一種豬傳染性胃腸炎病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用
【專利說明】一種豬傳染性胃腸炎病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及 其應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實(shí)時(shí)定 量檢測豬傳染性胃腸炎病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 豬傳染性胃腸炎（Porcine transmissible gastroenteritis, TGE)是一種 由α-冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒（transmissivle gastroenteritis virus of swine，TGEV)引發(fā)的豬的一種高度接觸傳染性疾病。該病毒可在易感動(dòng)物小腸絨毛上皮細(xì) 胞上復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞變性、絨毛縮短等并引起營養(yǎng)吸收障礙和腹瀉。不同年齡和品種豬均易 感。新生仔豬感染TGEV后20h內(nèi)呈現(xiàn)胃腸炎癥狀，在l-4d死亡，1周齡仔豬感染后死亡率 可達(dá)100%。
[0004] 豬傳染性胃腸炎（TGE)是一種世界范圍內(nèi)流行的疾病，美國的Doyle和 Hutchingsl946年首次道了 TGE，之后日本、英國、加拿大、朝鮮等許多國家相繼報(bào)道了本 病，呈現(xiàn)世界性分布。我國從20世紀(jì)50年代末期就有該病的報(bào)道，近年來全國各地區(qū)地區(qū) 時(shí)有發(fā)生與流行，并且經(jīng)常伴隨著與豬輪狀病毒病和豬流行性腹灣病的混合感染，目前無 有效的治療藥物，因此給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了極大地經(jīng)濟(jì)損失。由于TGE的發(fā)病日齡小，感染 率、死亡率高，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)已將其列為B類疾病中必檢的傳染病。因此，很有 必要對(duì)豬傳染性胃腸炎的快速診斷方法進(jìn)行研究來有效而快速地防控TGE。
[0005] 對(duì)豬傳染性胃腸炎病毒的快速準(zhǔn)確診斷是臨床上防治豬傳染性胃腸炎的關(guān)鍵。目 前已建立了病毒分離、免疫電子顯微鏡技術(shù)（IEM)、血清學(xué)試驗(yàn)、核酸探針和聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)等方法。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法盡管可以作為確診該病的最終診斷依據(jù)，但其操作 時(shí)間長，過程復(fù)雜，不適于快速檢測要求。IEM、核酸探針和PCR等技術(shù)具備敏感性高及特異 性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)試驗(yàn)條件要求比較高，需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，且操作相對(duì) 復(fù)雜，檢測成本高，只有專業(yè)檢測實(shí)驗(yàn)室才能配備，基層單位難以開展容易造成實(shí)驗(yàn)室污染 導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果，也不適合基層和現(xiàn)場檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了解決基層檢測豬傳染性胃腸炎病毒困難、耗時(shí)長和儀器昂貴 等問題，提供一種為基層簡便、快捷準(zhǔn)確地檢測豬傳染性胃腸炎病毒的試劑盒，為實(shí)現(xiàn)本發(fā) 明目的所使用的技術(shù)方案為：一種豬傳染性胃腸炎病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，該 試劑盒包括RT-LAMP引物、2X反應(yīng)緩沖液、EM、熒光目視檢測試劑、超純水和豬傳染性胃腸 炎病毒RNA模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3 (SEQ ID NO :1)與B3 (SEQ ID NO: 2)、內(nèi)引物 FIP (SEQ ID N0:3)與 BIP (SEQ ID N0:4)和環(huán)引物 LF (SEQ ID N0:5)與 LB (SEQ ID NO ：6)； 其中： F3 TCAACAGATTGGTTATTGGAAT B3 ATTAGCACCACGACTACC FIP AGTAGAAGAACCACCTTTCAGGAAGGACAAACTCGCTATCGCA BIP GTACTGGACCTCATGCAGATGCTTGTTCATGGCACCATCC LF CTCTTTACGTTGGCCCTTCAC LB GATGGAGTTGTCTGGGTTGC 所述的 2X 反應(yīng)緩沖液是 Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine 和 dNTPs〇
[0007] 以上所述的豬傳染性胃腸炎病毒RNA模板是使用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒 提取的豬傳染性胃腸炎病毒的RNA，自豬病變組織樣品或糞便中提取的豬傳染性胃腸炎病 毒的RNA。
[0008] 以上所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素?zé)晒庠噭?，熒光試劑在反?yīng)前加入。
[0009] 以上所述的 2X 反應(yīng)緩沖液包括 Tris-HCL 35-55mM、KCL 15-35mM、MgSO4 15-20mM、（NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0.4-0.8%、Betaine 1.5-3.0M 和 dNTPs 2.5-4mM，其 配制方法在pH為8. 6條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0010] 一種豬傳染性胃腸炎病毒逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的應(yīng)用，用于獸醫(yī)臨床上 檢測疑似豬傳染性胃腸炎病變組織或豬糞便排泄物中是否含有豬傳染性胃腸炎病毒，具體 檢測步驟包括： (1) RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成 (2) 豬傳染性胃腸炎病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反應(yīng)體系建立 (4) RT-LAMP檢測方法。
[0011] 以上所述的RT-LAMP反應(yīng)體系建立以25 μ 1計(jì)， 2X反應(yīng)緩沖液 12. 5 yL EM IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 豬傳染性胃腸炎病毒RNA 5 yL 超純水 補(bǔ)足25 μ L。
[0012] 以上所述的RT-LAMP檢測方法是采用特異性檢測、敏感性檢測和熒光可視化檢測 的方法。
[0013] 以上所述的RT-LAMP檢測方法采用Loopamp LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀進(jìn)行密閉全程監(jiān) 控，反應(yīng)溫度為63°C、反應(yīng)在10-30分鐘間出現(xiàn)擴(kuò)增。
[0014] 本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和進(jìn)步是： 1)特異性強(qiáng) 本發(fā)明的RT-LAMP檢測試劑盒特異性檢測的陰性對(duì)照病毒和水對(duì)照均無陽性結(jié)果出 來，與PCR檢測結(jié)果一致。且操作簡便、快速獲得檢測結(jié)果、無需昂貴復(fù)雜的儀器。
[0015] 2)靈敏度高 普通PCR檢測方法的靈敏度為I. 65X 10 5 ng/μ L，而使用本發(fā)明的RT-LAMP檢測方法， 檢測限約為1.65X 10 7 ng/μ L，是普通PCR的100倍。
[0016] 3)迅速獲得結(jié)果 普通的RT-PCR整個(gè)過程在24小時(shí)左右才能得出結(jié)果，目前多數(shù)建立的RT-LAMP反應(yīng) 方法在反應(yīng)結(jié)束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，從病毒基因組RNA 提取到獲取試驗(yàn)結(jié)果，需要4-5小時(shí)左右。本發(fā)明提供的RT-LAMP檢測方法反應(yīng)在10分鐘 左右出現(xiàn)擴(kuò)增，60分鐘內(nèi)即可完成擴(kuò)增，且結(jié)果判讀方式簡便，在可見光下將陽、陰性管進(jìn) 行比較，通過肉眼可明顯看到陽性反應(yīng)呈明顯渾濁，陰性反應(yīng)管透明；短暫離心后，陽性反 應(yīng)管底部有明顯的白色焦磷酸鎂沉淀物，而陰性反應(yīng)管底部無沉淀物；或加入熒光染料，陽 性反應(yīng)管在紫外光下呈綠色，用肉眼便可觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。不需要再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳紫 外線分析顯像來判定結(jié)果，從基因組RNA提取到獲得最終結(jié)果可在2-3小時(shí)內(nèi)完成。
[0017] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接觀察的熒光染料為反應(yīng)后加入，而本發(fā)明的熒光染料是在 反應(yīng)前加入的鈣黃綠素商用染料(非syber-green)，檢測過程不需要開蓋。此外，本發(fā)明的 RT-LAMP檢測方法在結(jié)果判定上，直接通過濁度儀檢測反應(yīng)管的濁度值來判定結(jié)果，可不進(jìn) 行熒光染料法檢測結(jié)果或者進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，不需要開蓋，能有效避免污染。
[0018] 5)可實(shí)時(shí)定量 本發(fā)明利用Tubidimeter real-time LA-320池度儀來實(shí)時(shí)分析RT-LAMP反應(yīng)的結(jié)果， 不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì)應(yīng)的濁度值的時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可 求出各時(shí)間的豬傳染性胃腸炎病毒拷貝數(shù)，達(dá)到定量檢測產(chǎn)物的目的。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明的RT-LAMP方法特異性檢測結(jié)果，其中1 :豬傳染性胃腸炎病毒；2 : 豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒；3 : 口蹄疫病毒；4 :豬瘟病毒；5 :圓環(huán)病毒2型；6 :豬細(xì)小 病毒；7 :偽狂犬病毒；8 :流行性腹瀉病毒；9 :空白對(duì)照(水)。結(jié)果顯示豬傳染性胃腸炎病毒 反應(yīng)管出現(xiàn)濁度的上升曲線，7株對(duì)照病毒反應(yīng)管和水對(duì)照反應(yīng)管均無擴(kuò)增。
[0020] 圖2和圖3是分別使用本發(fā)明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法進(jìn)行的豬傳染 性胃腸炎病毒敏感性檢測的結(jié)果。其中1:1.65x1ο 1 ng/μ L ;2 :1. 65 X 10°ng/μ L ;3: I. 65 X 10 ng/ μ L ；4 ： I. 65 X 10 2ng/ μ L ； 5 ： I. 65 X 10 3ng/ μ L ；6 ： I. 65 X 10 4ng/ μ L ；7 ： L 65X 10 5ng/yL ;8 :1· 65X 10 6ng/yL ;9 :1· 65X 10 7 ng/yL ;10 :水。豬傳染性胃腸炎病 毒基因組RNA的起始濃度為I. 65 X IO1 ng/ μ L，經(jīng)10倍倍比連續(xù)稀釋后，進(jìn)行RT-LAMP和 PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示本發(fā)明的RT-LAMP法檢測限約為1. 65 X 10 7 ng/μ L，而普通PCR方法檢 測限約為 1.65X 10 5ng/μ L。
[0021] 圖4是加入熒光染料后肉眼觀察結(jié)果：左管為以豬傳染性胃腸炎病毒基因組RNA 為模板的反應(yīng)情況，為陽性結(jié)果，右管為陰性對(duì)照的反應(yīng)情況，為陰性結(jié)果。
[0022] 圖5是本發(fā)明豬傳染性胃腸炎病毒定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：利用不同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度對(duì) 應(yīng)的濁度值對(duì)時(shí)間繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可求出各時(shí)間的豬傳染性胃 腸炎病毒拷貝數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 1、材料的準(zhǔn)備 豬傳染性胃腸炎病毒、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、圓環(huán)病 毒2型、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒和豬流行性腹瀉病毒，均為市售疫苗。RT-LAMP RNA擴(kuò)增試 劑盒購自北京藍(lán)譜生物科技有限公司，貨號(hào)LMP204 ;病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，購自 康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)CW0548。
[0024] 2、RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中的豬傳染性胃腸炎病毒N基因序列，利用RT-LAMP法引物輔助設(shè)計(jì)軟 件PrimerExplorer V4軟件設(shè)計(jì)一套R(shí)T-LAMP引物，其中F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi) 引物，LF和LB為環(huán)引物，其中 F3 TCAACAGATTGGTTATTGGAAT B3 ATTAGCACCACGACTACC FIP AGTAGAAGAACCACCTTTCAG