能特異性結(jié)合黃曲霉毒素的納米抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)（又稱納米抗體技術(shù)），以及基因工程抗體技術(shù)，特 別是針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體或多肽。 技術(shù)背景
[0002] 黃曲霉毒素（Afiatoxin)是由黃曲霉（Aspergillus fIavus)、寄生曲霉 (Aspergillus parasiticus)、集蜂曲霉（Aspergillus nomius)和溜曲霉（Aspergillus tamarii)等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)致癌性和強(qiáng)免疫抑制性。黃曲霉毒素是一類 化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素衍生物，主要包括黃曲霉毒素 B1 (AFB1)、B2(AFB2)、G1 (AFG1)、 G2(AFG1)和M1 (AFM1)等。在已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素 B1的毒性最強(qiáng)，被世界衛(wèi)生 組織的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為I類致癌物。產(chǎn)毒真菌菌株廣泛存在于自然界中，糧食油料等 農(nóng)產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工以及儲藏等過程中均可能受到污染，導(dǎo)致黃曲霉毒素超標(biāo)。我國是黃曲 霉毒素污染情況較為嚴(yán)重的地區(qū)。因此，開發(fā)穩(wěn)定、快速、高靈敏、高通量的黃曲霉毒素檢測 方法，對于保障我國食品安全、減少由此帶來的損失具有重要意義。
[0003] 現(xiàn)有的黃曲霉毒素檢測方法主要有免疫分析法、儀器分析法以及薄層層析法。其 中免疫分析法可避免其它兩類方法存在的一些缺陷，具有靈敏度高、成本低以及可現(xiàn)場檢 測等優(yōu)點。免疫分析法的原理是基于抗原抗體的特異性識別，抗體的性能是免疫分析方法 靈敏度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)的決定性因素。因此獲得針對黃曲霉毒素的抗體是建立相關(guān)免疫學(xué) 檢測技術(shù)的前提和關(guān)鍵。
[0004] 單域重鏈抗體（又稱納米抗體）是由羊駝重鏈抗體的可變區(qū)組成，又稱為納米抗 體，具有耐酸堿、耐高溫以及易于生產(chǎn)等特性。這些特性對于黃曲霉毒素的低成本、可重復(fù) 使用的免疫學(xué)檢測方法有重要的實用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測黃曲 霉毒素的試劑和工具。
[0006] 本發(fā)明提供一個針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體（即本發(fā)明能特異性結(jié)合黃 曲霉毒素的納米抗體，下同），具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的 IMGT編號和結(jié)構(gòu)域的劃分包括四個框架區(qū)（Framework region，F(xiàn)R)和三個互補(bǔ)決定區(qū) (Complementarity-determining region, CDR)〇
[0007] 本發(fā)明提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO. :1，通過遺傳密碼子可以隨 時獲得該核酸分子的具體序列。
[0008] 本發(fā)明還提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO. :1部分結(jié)構(gòu)域，通過遺傳 密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列?？梢詾镾EQ ID NO. :2核酸分子。
[0009] 本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表 達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細(xì)胞，昆蟲 細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
[0010] 本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡并性，該核酸 序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。
[0011] 本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明還提供一種檢測黃曲霉毒素的方法，含有本發(fā)明所述針對黃曲霉毒素 的單域重鏈抗體?；诒景l(fā)明提供的針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體與黃曲霉毒素特 異性結(jié)合的能力，建立黃曲霉毒素的檢測方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶連免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)， 免疫芯片法，親和層析法和免疫層析法等。
[0013] 本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機(jī)或定點突變技術(shù)進(jìn)行改造， 能夠獲得性質(zhì)（水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等）更好的突變體。
[0014] 本發(fā)明還涉及前述針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體在免疫檢測、黃曲霉毒素富集 以及純化中的應(yīng)用。這些免疫檢測指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測。
[0015] 本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語具有如下含義：
[0016] 結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
[0017] IMGT 編號：IMGT 數(shù)據(jù)庫（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一 種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(xiàn)（Ehrenman，F(xiàn).， Q. Kaas,et. al. (2010). IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign ：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies，T cell receptors, MHC,IgSF and MhcSF. Nucleic Acids Res 38 (Database issue) :D301_307.Lefranc，M.P.，C.Pommie，et al. (2003). IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-Iike domains Dev comp Tmmunol 27(1) :55-77.)中的描 述。
[0018] 密碼子（codon):又稱為三連體密碼子（triplet code)，指對應(yīng)于某種氨基酸的 核苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。
【具體實施方式】
[0019] 下面通過單域重鏈抗體（多肽）的制備、分析及應(yīng)用，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，這 些具體實施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0020] 實施例1 :
[0021] 抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體（即針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體）免疫文庫的構(gòu) 建
[0022] 將黃曲霉毒素隊與匙孔血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH)共價偶聯(lián)， 得到黃曲霉毒素人工抗原AFB1-KLH,取300 μ g AFB1-KLH與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝 (Lama pacos)進(jìn)行皮下多點注射免疫。加強(qiáng)免疫采用150 μ g AFB1-KLH與弗氏不完全佐劑 乳化，間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價，選擇血清 效價最高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取RNA。
[0023] RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進(jìn)行。以RNA為模板，oligo dT 為引物，參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
[0024] 采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經(jīng)巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因 (采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件為， 98Γ，10s，55Γ，20s，72Γ，lmin，20 個循環(huán)，98Γ，10s，68Γ，lmin，72Γ延伸 lOmin。
[0025] 將第一輪PCR產(chǎn)物用1. 2 %的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp~750bp的DNA片 段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHRl-Notl，AlpVh-SfiI和 八1口￥冊1?2-如《，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98°(：，1〇8,50°(：，2〇8,72°(：，4〇8,5個循環(huán)，98°(：， 108,68°(：，408,30個循環(huán)，72°(：延伸101^11。經(jīng)0嫩片段回收試劑盒回收、定量，于-20°(：保 存?zhèn)溆?。將噬菌粒pHENl和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、 定量后，以1 : 3摩爾比，在16°C，過夜連接。
[0026] 表1文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物
[0028] 注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識別序列
[0029] 連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10 μ L無菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TGl。取IOyL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2 X YT培養(yǎng)板，37°C，倒置 培養(yǎng)12~16h，采用引物M13-R和pHEN-R進(jìn)行菌落PCR，計算庫容；其余部分全部涂布于 24〇1^24〇11氨芐青霉素2\￥1'培養(yǎng)板，37°(：，倒置培養(yǎng)12~1611。用1〇1^，2\￥1'培養(yǎng)基將 培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15~30%甘油，分裝，-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 根據(jù)計算的庫容量結(jié)果，接種10倍庫容量的活細(xì)胞于20mL的2XYT(含2%葡萄 糖，lOOyg/mL氨芐青霉素），30°C，220r/min培養(yǎng)至0D600達(dá)0. 5胺感染復(fù)數(shù)20 : 1加入 輔助噬菌體，37°(：，22(^/11^11，6〇1^11。將培養(yǎng)物離心，用5〇1^的2\￥1'(含10(^8/1^氨芐 青霉素和50 μ g/mL卡那霉素）重懸沉淀，30°C，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清， 加入5XPEG/NaCl溶液，冰上放置Ih或4°C過夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10% 甘油的磷酸緩沖液（PBS，0.01M，pH 7. 4)，即得到抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體免疫文庫，取 10 μ L測定滴度，其余分裝于-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0031] 實施例2:
[0032] 抗黃曲霉毒素單域重鏈抗體的淘選與鑒定