一種金黃垂直鏈霉菌hn6的固體發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明涉及微生物固體發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種金黃垂直鏈霉菌HN6的固 體發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃垂直鏈霉菌 HN6 (HN6)，已于 2010 年 11月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：中國(guó)武漢市武漢大學(xué)，郵編 430072)，保藏號(hào)為CCTCC No. M2010293,屬于鏈霉菌屬，該菌株菌落較小，干燥，呈粉白色； 基內(nèi)菌絲橙紅色，無可溶性色素，氣生菌絲纖細(xì)、多分枝，分枝呈垂直狀；孢子絲直，孢子鏈 成熟后斷裂成分生孢子，分生孢子圓柱形。菌株有較強(qiáng)的淀粉水解能力，并能夠很好利用多 種糖類，如果糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等作為碳源生長(zhǎng)。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)：（1)金黃垂直鏈霉菌HN6對(duì)香蕉枯萎病原菌在內(nèi)的多種植物病原菌有 極強(qiáng)的抑菌活性；（2)金黃垂直鏈霉菌HN6對(duì)尖孢鐮刀菌古巴專化型 /.耶.cMe?? F0C)侵染引起的香蕉枯萎病有很好的防治作用；（3)金黃垂直鏈霉菌HN6 能明顯提高組培香蕉苗苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的活性；（4)金黃垂直鏈霉菌 HN6可以增加組培香蕉苗株高、莖粗、地上部分鮮重及地下部分鮮重；（5)金黃垂直鏈霉 菌HN6可以提高植株葉片葉綠素、可溶性蛋白質(zhì)及可溶性糖含量；（6)金黃垂直鏈霉菌 HN6可有效增強(qiáng)組培香蕉苗根系活力。由此申請(qǐng)了"一株金黃垂直鏈霉菌HN6及其應(yīng)用 ZL201110062146. 5"的發(fā)明專利和相關(guān)論文"王蘭英，王琴，駱焱平.金黃垂直鏈霉菌 HN6對(duì)香蕉的防病促生作用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015, 43(05): 1-6 "。
[0004] 以往香蕉枯萎病防治試驗(yàn)中主要采用金黃垂直鏈霉菌HN6孢子懸浮液或液體發(fā) 酵物， 液態(tài)培養(yǎng)物容易實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)，產(chǎn)品濃度高，但液態(tài)培養(yǎng)物不易儲(chǔ)存和運(yùn)輸，因此利用 微生物固態(tài)發(fā)酵技術(shù)的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，探索金黃垂直鏈霉菌HN6固體發(fā)酵工藝條件具有重要的 意義。
[0005] 隨著各種生防微生物的不斷分離、獲得以及生防機(jī)制的深入研究，微生物活體防 治植物病害備受關(guān)注。固體發(fā)酵是微生物常用的培養(yǎng)工藝，操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)孢量大，培養(yǎng)物便 于儲(chǔ)存、運(yùn)輸和田間應(yīng)用，在活體微生物防治植物病害中具有廣闊的前景。采用固態(tài)發(fā)酵技 術(shù)生產(chǎn)微生物活體制劑具有較明顯的優(yōu)越性。
[0006] 玉米粉、麩皮等都是微生物固體發(fā)酵的重要原料，但近年來糧食作物種植面積持 續(xù)下降，使得發(fā)酵成本急劇增高，因此尋找新的固體發(fā)酵基質(zhì)資源迫在眉睫。木薯粉不僅含 有殘余的淀粉、蛋白質(zhì)，還含有維生素養(yǎng)分。在食用菌栽培中木薯粉不僅可以提供碳源、氮 源、無機(jī)鹽，甚至可以提供食用菌所必需的生長(zhǎng)素。因此將木薯粉應(yīng)用于微生物固體發(fā)酵技 術(shù)具有重要的理論意義。香蕉是世界上四大水果之一，通常收獲香蕉果實(shí)是香蕉種植者的 唯一目的。香蕉收獲后，大量的莖、葉等資源作為廢棄物，丟棄于田間地頭，不僅浪費(fèi)資源， 也給環(huán)境帶來巨大負(fù)擔(dān)。但有研究證明香蕉這些副產(chǎn)物中，含有大量豐富的蛋白質(zhì)、糖、維 生素等營(yíng)養(yǎng)成分，無氮浸出物的含量可達(dá)60%之上。用香蕉副產(chǎn)物堆制的有機(jī)肥不僅可提 升土壤有機(jī)質(zhì)，增加土壤中N、P、K等元素的含量，也可以改善土壤理化性狀，甚至可增強(qiáng)植 株抗病力，促進(jìn)香蕉根的生長(zhǎng)。因此，以香蕉莖、葉等副產(chǎn)物作為香蕉防病微生物固體發(fā)酵 基質(zhì)，最終將發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于香蕉種植必將帶來可觀的效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種金黃垂直鏈霉菌HN6的固體發(fā)酵方法。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該金黃垂直鏈霉菌HN6固體發(fā)酵物在防治香蕉枯 萎病中的應(yīng)用方法。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)所述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種金黃垂直鏈霉菌HN6的固體發(fā)酵方法，包括以下步驟： 1) 菌種活化：將菌種以劃線法接種在擴(kuò)大培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)5天，其中，所述菌 種為金黃垂直鏈霉菌 HN6 ayreoKeriiciWaiiA? HN6); 2) -級(jí)種子制備：將活化的金黃垂直鏈霉菌HN6制成濃度為109cfu/g孢子懸浮液，然 后按照5%的接種量接種于裝有一級(jí)種子培養(yǎng)液的三角瓶中，180轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，28°C下培養(yǎng) 72小時(shí)，制得一級(jí)種子，備用； 3) 二級(jí)種子制備：將制備好的一級(jí)種子培養(yǎng)液按照5%接種量接種在裝有二級(jí)種子培 養(yǎng)液的三角瓶中，180轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，28°C下培養(yǎng)72小時(shí)，制得二級(jí)種子，備用； 4) 三級(jí)種子制備：按照10%的接種量將二級(jí)種子接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，放 入淺盤內(nèi)，在無菌培養(yǎng)室保持濕度50%-70%和溫度28°C，培養(yǎng)96小時(shí)，制得三級(jí)種子；和 5) 固體發(fā)酵，將配制好的固體發(fā)酵培養(yǎng)基加入到固體發(fā)酵罐內(nèi)，裝料系數(shù)為50%-60%， 115°C高溫高壓滅菌30分鐘；待罐內(nèi)培養(yǎng)基冷卻至30-40°C時(shí)，將三級(jí)種子按照接種量10% 接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌均勻，保持濕度60%-70%和溫度28°C，發(fā)酵培養(yǎng)96小時(shí)，獲得金 黃垂直鏈霉菌HN6固體發(fā)酵培養(yǎng)物。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟1)中，所述的培養(yǎng)基為：可溶性淀粉2%、KNO3 0. 1%、K2HPO4 0. 05%、 MgSO4 0.05%、NaCl 0.05%、FeS04 0 . 001%，瓊脂2%，補(bǔ)水至100%，上述百分比為質(zhì)量百分比， 待藥品全部溶解后，調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2,121°C高溫高壓滅菌20分鐘。
[0011] 進(jìn)一步的，所述的一級(jí)種子液為：可溶性淀粉2%、KNO3 0. 1%，K2HPO4 0. 05%、MgSO4 0. 05%、NaCl 0. 05%、FeSO4 0. 001%，補(bǔ)水至100%，上述百分比為質(zhì)量百分比，待藥品全部溶 解后，調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2,121°C高溫高壓滅菌20分鐘。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的二級(jí)種子液為：葡萄糖0. 05%、可溶性淀粉0. 05%、K2HP04 0 . 05%、 NaCl 0. 05%、MgSO4 0. 05%、蛋白胨0. 05%、酵母膏0. 05%和黃豆粉0. 05%，補(bǔ)水至100%，上述 百分比為質(zhì)量百分比，待藥品全部溶解后，調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 0,121°C高溫高壓滅菌20分 鐘。
[0013] 進(jìn)一步的，所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基為木薯粉、豆餅粉、香蕉秸桿渣、細(xì)沙土為基料， 木薯粉、香蕉秸桿渣制備：將木薯及香蕉秸桿晾曬至干，粉碎、過30目篩，制成木薯粉及香 蕉秸桿渣，備用，木薯粉、豆餅粉、香蕉秸桿渣、細(xì)沙土按照13:3:3:1質(zhì)量比例混合，隨后加 入葡萄糖0.05%、]\%50 4 0 . 05%、恥(：10.05%，1(2冊(cè)04 0 . 02%、腿2?04 0 . 02%，上述百分比為質(zhì)量 百分比，混勻的固體基質(zhì)與水以1:1. 2質(zhì)量比例攪拌均勻，115°C高溫高壓滅菌30分鐘，冷 卻后備用。
[0014] 所述的金黃垂直鏈霉菌HN6固體發(fā)酵培養(yǎng)物采用系列梯度稀釋法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)， 最終統(tǒng)計(jì)發(fā)酵物的活菌體濃度達(dá)6. 0-8. 7 X IO9Cfu g、
[0015] 本發(fā)明有益效果：（1)本發(fā)明采用木薯粉、香蕉秸桿渣、細(xì)沙土為固體基質(zhì)，配方 獨(dú)特，成本低廉，最終發(fā)酵產(chǎn)物活菌濃度可達(dá)6. 0-8. 7 X IO9Cfu g \發(fā)酵效率高。（2)本發(fā)明 所需用固體發(fā)酵設(shè)備簡(jiǎn)單，不需要特殊裝置，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。（3)本發(fā)明固體基質(zhì)中的木 薯粉和香蕉秸桿渣在海南十分豐富，且香蕉秸桿渣被變廢為寶，該材料具有區(qū)域優(yōu)勢(shì)。（4) 本發(fā)明最終培養(yǎng)物對(duì)尖孢鐮刀菌古巴?；颓秩疽鸬南憬犊菸》乐畏椒ê?jiǎn)單，防治效 果突出，不易造成環(huán)境污染。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0017] 實(shí)施例1金黃垂直鏈霉菌HN6固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程 (1)菌種活化： 本發(fā)明所用菌種為金黃垂直鏈霉菌HN6 ayreoKeriiciWaiiA? HN6)， 將菌種以劃線法接種在擴(kuò)大培養(yǎng)基（可溶性淀粉2%，KN03 0. 1%，K2HP04 0. 05%、MgS04 0. 05%、NaCl 0. 05%、FeS04 0. 001%，瓊脂2%，補(bǔ)水至100%，待藥品全部溶解后，調(diào)節(jié)pH至 7. 0-7. 2,121°C高溫高壓滅菌20min。）固體平板上，28°C恒溫培養(yǎng)5天。
[0018] (2)-級(jí)種子制備： 將活化的金黃垂直鏈霉菌HN6制成濃度為109cfu g 1孢子懸浮液，然后按照5%的接種 量接種于裝有一級(jí)種子培養(yǎng)液(溶性淀粉2%，KNO3 0. 1%，K2HPO4 0. 05%、MgSO4 0. 05%、NaCl 0. 05%、FeS04 0 . 001%，補(bǔ)水至100%，待藥品全部溶解后，調(diào)節(jié)pH至7. 0-7. 2,121°C高溫高壓 滅菌20min)的三角瓶中，180 r · min 1JScC培養(yǎng)72h，制得一級(jí)種子，備用。
[0019] (3)二級(jí)種子制備： 將制備好的一級(jí)種子培養(yǎng)液按照5%接種量接種在裝有二級(jí)種子培養(yǎng)液(葡萄糖 0· 05%、可溶性淀粉 0· 05%、K2HPO4 0· 05%、NaCl 0· 05%、MgSO4 0· 05%、蛋白胨 0· 05%、酵母膏 0. 05%和黃豆粉0. 05%，補(bǔ)水至100%，待藥品全部溶解后，調(diào)節(jié)pH至6. 8-7. 0,121°C高溫高 壓滅菌20min)的三角瓶中，18