一種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細胞原代分離方法，特別是涉及一種動物皮膚成纖維細胞原代分 離方法，屬于干細胞培養(yǎng)領域。
【背景技術】
[0002] 目前成纖維細胞主要是用于研究細胞的老化、各種外來因子對細胞的損傷、細胞 在體外條件下的惡性轉化、以及某些先天性代謝異常、酶缺陷等。由于皮膚成纖維細胞易于 獲取，又易于在體外生長，皮膚成纖維細胞培養(yǎng)已在基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學研究中得到較廣 泛的運用。
[0003] 對于成纖維細胞的獲取，目前已有的原代分離方法主要有兩種：（1)酶消化法。用 胰蛋白酶或膠原酶對用含雙抗PBS漂洗干凈并剪碎的皮膚組織進行消化，直至細胞分離出 來，過200篩，離心、重懸、計數細胞密度并接種培養(yǎng)。（2)組織塊貼壁法。分別用含雙抗的 PBS和75 %乙醇漂洗干凈皮膚組織，眼科剪把皮膚組織剪碎成Imm3組織塊，用培養(yǎng)基接種 于6孔板中進行培養(yǎng)。
[0004] 對于酶消化法，雖然能在較短時間內得到細胞，但是酶本身對細胞的貼壁有一定 的影響，多次離心也對細胞造成一定的機械損傷，造成細胞活率不高，貼壁率低。而組織塊 貼壁法相對酶解法步驟較為簡單，但是周期長，貼壁穩(wěn)定性低，細胞爬出率低。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種細胞活率較高、貼壁率較高的動物皮膚成纖維細胞原 代分離方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)。
[0007] -種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法，它包括以下步驟：
[0008] 選取動物皮膚，優(yōu)選腹部皮膚，皮膚經碘酒和/或酒精消毒，做一個全層皮膚傷 口，優(yōu)選做一個直徑為1.0 cm~3. Ocm的圓形全層皮膚傷口。
[0009] 皮膚損傷3-5天內，取下?lián)p傷后皮膚區(qū)域，將皮下組織和所有血管去除干凈，用含 2%雙抗的PBS清洗皮膚2~3次。
[0010] 把皮膚轉至離心管中，優(yōu)選50ml的離心管，然后按照皮膚面積lmL/cm2的標準，加 入質量百份比為〇. 1% -〇. 25%的胰蛋白酶，37°C放置1-2小時。
[0011] 去除消化液中無法消化的組織和雜質，優(yōu)選通過過篩的方式去除消化液中無法消 化的組織和雜質，然后lOOOrpm/min低速離心5min，去除上清液；再倒入適量的含1%雙抗 的PBS，然后1000rpm/min低速離心5min，去除上清液，以去除殘留的胰蛋白酶。
[0012] 離心后的細胞，按照（1-10) X IO5的密度標準，加入培養(yǎng)基重懸細胞，優(yōu)等的培養(yǎng) 基為：DMEM+10% FBS+2% 雙抗。
[0013] 將重懸的細胞懸液均勻接種至已包被了 0. 2%明膠的細胞培養(yǎng)皿中，放至37°C、 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)2-5天，優(yōu)選9cm細胞培養(yǎng)皿。
[0014] 所述包被了 0. 2%明膠的細胞培養(yǎng)皿是提前在細胞培養(yǎng)皿中加入0. 2%明膠，孵 育 30min。
[0015] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明動物皮膚成纖維細胞原代分離方法具有以下優(yōu)點：（1) 本發(fā)明利用皮膚損傷愈合的機制，對皮膚進行損傷，以刺激成纖維細胞的生長，再配合酶消 化法，以增加細胞數量，減少酶對細胞影響，獲得了更多的成纖維細胞及高增殖低凋亡型的 成纖維細胞，提高了細胞分離效率和貼壁效果。（2)選擇皮膚損傷愈合的天數為3-5天，這 個時候成纖維細胞處于增殖期，且細胞凋亡處于低發(fā)期。（3)消化皮膚時，先去除皮下組織， 減少組織對分離細胞的影響。（4)縮短了胰蛋白酶消化時間，減少對細胞的影響以及提高工 作效率。（5)在接種的時候，提前進行0.2%明膠鋪板，可有效提高皮膚組織貼壁速度和貼 壁率。
【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例4的小鼠皮膚成纖維細胞原代分離后的成纖維細胞增殖曲線；
[0017] 圖2是實施例5的對照組小鼠皮膚成纖維細胞的流式鑒定圖，其中2-A是CK15的 流式鑒定圖；2-B是Vimentin的流式鑒定圖；
[0018] 圖3是實施例5的實驗組小鼠皮膚成纖維細胞的流式鑒定圖，其中3-A是CK15的 流式鑒定圖；3-B是Vimentin的流式鑒定圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0020] 實施例1
[0021] 本實施例的一種小鼠皮膚成纖維細胞原代分離方法，它包括以步驟：
[0022] I. 1選取小鼠腹部皮膚，用彎頭剪刀稍微把毛減掉，皮膚經碘酒、酒精消毒，做一個 直徑為2. Ocm的圓形全層皮膚傷口，傷口暴露繼續(xù)飼養(yǎng)。
[0023] 1. 2皮膚損傷（3-5)天內，處死小鼠，取下?lián)p傷后皮膚區(qū)域，將皮下組織和所有血 管去除干凈，用含2%雙抗的PBS清洗皮膚3次。
[0024] 1. 3把皮膚轉至50mL離心管中，加入7ml (按照皮膚面積lmL/cm2選擇培養(yǎng)基體 積）（0· 1% -0· 25% )胰蛋白酶，放置1-2小時。
[0025] 1. 4將消化液過200目細胞網篩，去除無法消化的組織和雜志，lOOOrpm/min低速 離心5min，去除上清，倒入適量的含1%雙抗的PBS，去除殘留的胰蛋白酶，1000rpm/min低 速離心5min，去除上清。
[0026] L 5離心后的細胞，根據（1-10) X IO5的密度，加入培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS+2%雙 抗）重懸細胞。
[0027] 1. 6提前在9cm細胞培養(yǎng)皿中加入0. 2 %明膠，ImL/孔，孵育30min，回收明膠。細 胞懸液均勻接種至9cm細胞培養(yǎng)皿中，放至37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
[0028] 實施例2
[0029] 本實施例是傳統(tǒng)的常規(guī)小鼠皮膚成纖維細胞的原代分離方法，包括以下步驟：
[0030] 2. 1處死小鼠，用彎頭剪刀稍微把毛減掉，皮膚經碘酒、酒精消毒，取下直徑為2cm 的皮膚組織，用含2%雙抗的PBS清洗皮膚3次。
[0031] 2· 2把皮膚轉至50mL離心管中，加入按照皮膚面積加入7mL/cm2(0. 1% -0· 25% ) 胰蛋白酶，放置4-6小時。
[0032] 2. 3將消化液過200目細胞網篩，去除無法消化的組織和雜志，lOOOrpm/min低速 離心5min，去除上清，倒入適量的含1%雙抗的PBS，去除殘留的胰蛋白酶，1000rpm/min低 速離心5min，去除上清。
[0033] 2. 4離心后的細胞，根據（1-10) X IO5的密度，加入培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS+2%雙 抗）重懸細胞。
[0034] 2. 5細胞懸液均勻接種至9cm細胞培養(yǎng)皿中，放至37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中進行培 養(yǎng)。
[0035] 實施例3
[0036] 本實施例是小鼠皮膚成纖維細胞分離后的細胞數量對比
[0037] 分別使用實施例1 (實驗組）和實施例2 (對照組）的方法處理三個不同批次的小 鼠，計算分離后每平方厘米皮膚的細胞數。接種后每天觀察細胞生長情況。
[0038] 兩個方案分離后的細胞數，如下表：
[0039] 表1 :實驗組和對照組的皮膚成纖細胞分離后的細胞數量對比表
[0041] 從表中可見，實驗組分離的細胞數是對照組的2倍以上，證明本發(fā)明方案能極大 提高分離的細胞數量。
[0042] 實施例4
[0043] 本實施例是小鼠皮膚成纖維細胞原代分離后的成纖維細胞增殖曲線。
[0044] 采用CCK-8法檢測培養(yǎng)的成纖維細胞的增殖活力。分別按照實施例1 (實驗組） 和實施例2 (對照組）的分離方法分離，待細胞匯合度長至90%時，分別收集細胞，接種細胞 于96孔板中，2000個/孔。在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d，分別在1(1、3(1、5(1、7(1對 細胞進行檢測。在待檢測孔中加入10 μ L染色劑，37°C，5% CO2培養(yǎng)2h。用酶標儀測450nm 處的吸光值，每個樣本做3個重復，結果見表2和圖1。
[0045] 表2 :實驗組和對照組的皮膚成纖細細胞分離后吸光值對比表
[0046]
[0047] 從表2和圖1可知，實驗組的增殖明顯大于對照組。
[0048] 實施例5
[0049] 本實施例是小鼠皮膚成纖維細胞的流式鑒定。
[0050] 5. 1分別取實施例1和實施例2中分離長至90%以上的細胞，進行消化，終止、重 懸，取I X 106cells，平均分至2個EP管中，一管作為對照，1500rpm/min離心5min，棄上清。
[0051] 5. 2加入ImL染色緩沖液（含10% FBS的PBS)重懸細胞，1500rpm/min離心5min， 棄上清。重復以上步驟1次。
[0052] 5. 3棄上清后，每管加入200 μ L染色緩沖液重懸，樣本組分別加入2 μ L波形蛋白 抗體（Vimentin)和角蛋白抗體（CK15抗體）。避光孵育20min。
[0053] 5. 4加入500 μ L染色緩沖液重懸，1500rpm/min離心5min洗掉剩余抗體。
[0054] 5. 5棄上清，加入500 μ L上樣緩沖液（10% FBS+1640培養(yǎng)基），過200目篩，上機 檢測細胞表面抗原。
[0055] 表3 :實驗組和對照組細胞流式鑒定對比表
[0057] 成纖維細胞表面標記物CK15表達陰性（5 2% )，Vimentin表面標記物表達達陽 性（3 95%)。由表2及圖2、圖3可知，對照組除成纖維細胞參雜了其他細胞，而實驗組中 為100 %成纖維細胞，該分離方法所得細胞純度高。
[0058] 根據實施例3-5,本發(fā)明的分離方法相比于傳統(tǒng)分離方法所得的成纖維干細胞更 多，增值速度更快，純度更高。
[0059] 本發(fā)明并不限于以上實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干變通，這些變通也屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法，它包括以下步驟： 選取動物皮膚，皮膚經碘酒和/或酒精消毒，做一個全層皮膚傷口； 皮膚損傷3-5天內，取下?lián)p傷后皮膚區(qū)域，將皮下組織和所有血管去除干凈，用含2% 雙抗的PBS清洗皮膚2~3次； 把皮膚轉至離心管中，然后按照皮膚面積lmL/cm2的標準，加入質量百份比為 0. 1% -0. 25%的胰蛋白酶，37°C放置1-2小時； 去除消化液中無法消化的組織和雜質，然后l〇〇〇rpm/min低速離心5min，去除上清液； 再倒入含1 %雙抗的PBS，然后1000rpm/min低速離心5min，去除上清液，以去除殘留的胰蛋 白酶； 離心后的細胞，按照（1-10)X105的密度標準，加入培養(yǎng)基以重懸細胞，培養(yǎng)基為：DMEM+10%FBS+2% 雙抗； 將重懸的細胞懸液均勻接種至已包被了 0. 2%明膠的細胞培養(yǎng)皿中，放至37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)2~5天； 所述包被了 〇. 2 %明膠的細胞培養(yǎng)皿是提前在細胞培養(yǎng)皿中加入0. 2 %明膠，孵育 30min〇2. 根據權利要求1所述的一種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法，其特征在于：所述 的動物皮膚優(yōu)選腹部皮膚。3. 根據權利要求1所述的一種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法，其特征在于：所述 的全層皮膚傷口為直徑為1. 〇cm~3. 0cm的圓形全層皮膚傷口。4. 根據權利要求1所述的一種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法，其特征在于：所述 去除消化液中無法消化的組織和雜質是根據細胞的大小采用過篩的方式進行。5. 根據權利要求1所述的一種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法，其特征在于：所述 離心管為50ml離心管，培養(yǎng)皿為9cm細胞培養(yǎng)皿。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種動物皮膚成纖維細胞原代分離方法，它利用皮膚損傷愈合機制，選擇合適的愈合時段，得到大量增殖型的成纖維細胞，同時縮短酶消化時間，能很好克服了上述技術缺點，可以增加細胞數量，減少酶對細胞影響，提高細胞分離效率和貼壁效果。
【IPC分類】C12N5/071
【公開號】CN105400733
【申請?zhí)枴緾N201510862177
【發(fā)明人】葛嘯虎, 陳海佳, 王一飛, 吳子杰, 李平
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年11月30日