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用于培養(yǎng)干細胞衍生的心肌細胞的合成表面的制作方法_2

文檔序號:9642212閱讀:來源:國知局
)丙烯酸酯單體,選自下表1中提供的一組單體。其它材料(未示出)如 肽可加入或結(jié)合入合成聚合物表面以產(chǎn)生仿生表面。
[0028] 表1 :丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯單體列表
[0029]

[0031] 表1中列舉的丙烯酸酯可通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的方式合成或得自供貨商如 聚合科學股份有限公司(P〇lysciences,Inc.)、西格瑪阿帝奇股份有限公司(Sigma Aldrich, Inc.)和斯托默股份有限公司(Sartomer, Inc.) 〇
[0032] 如圖IB所示,中間層30可置于基底材料10的表面15與合成聚合物涂層20之 間。中間層30可構(gòu)造為改善涂層20對基材10的粘結(jié),以促進單體擴散,賦予表面10的未 涂覆的部分以細胞厭惡的物質(zhì)從而促進細胞在涂覆的區(qū)域上生長,以提供與單體或溶劑相 容的基材(其中所述單體或溶劑與基底材料10不相容),從而提供結(jié)構(gòu)特征(如果需要的 話,例如通過圖案印刷等)。例如,如果基材10是玻璃基材,理想的是用環(huán)氧涂層或硅烷涂 層處理玻璃基材的表面。對于不同的聚合物基底材料10,理想的是提供聚酰胺、聚酰亞胺、 聚丙烯、聚乙烯或聚丙烯酸酯的中間層30。盡管未示出,要理解,合成聚合物涂層20可置于 中間層30的一部分上。還要理解,中間層30可置于基底材料10的一部分上。
[0033] 在各個實施方式中,用物理方法或化學方法處理基底材料10的表面15以賦予表 面15理想的性能或特性。例如,如下所述,表面15可用電暈放電處理或等離子體處理。真 空或大氣壓等離子體的例子包括射頻(RF)和微波等離子體(原發(fā)的和次生的)、介電勢 皇放電和分子或混合氣體中產(chǎn)生的電暈放電,所述氣體包括空氣、氧氣、氮氣、氬氣、二氧化 碳、一氧化二氮或水蒸氣。
[0034] 合成聚合物涂層20,無論置于中間層30或基底材料10上時,優(yōu)選均勻地涂覆下層 的基材。通過"均勻地涂覆",意味著在給定區(qū)域如培養(yǎng)皿的井壁的表面上的層20以約5nm 或更大的厚度完全地涂覆該區(qū)域。雖然均勻地涂覆的表面的厚度可在表面上改變,但是沒 有均勻地涂覆的表面區(qū)域,通過該區(qū)域暴露下層(中間層30或基底材料10)。非均勻的表 面上的細胞響應比之均勻表面上的細胞響應更為不定。
[0035] 合成聚合物涂層20可具有任何理想的厚度。但是,已經(jīng)發(fā)現(xiàn),較厚的涂層,如大于 約10微米的涂層,在涂層的周邊會更為均勻,由于表面張力的原因。在各個實施方式中,涂 層20的厚度小于約10微米。例如,厚度可以小于約5微米,小于約2微米,小于約1微米, 小于約0. 5微米或小于約0. 1微米。
[0036] 形成合成聚合物層20的聚合物材料可以交聯(lián)至任何合適的程度。較高的交聯(lián)度 會導致減少的廢棄物和減少的細胞毒性。
[0037] 制品100,在許多實施方式中,是具有井的細胞培養(yǎng)器皿,如培養(yǎng)皿、多井板、燒瓶、 燒杯或其它具有井的容器。以下參看圖2,由基底材料10形成的制品100可包括一個或多 個井50。井50包括側(cè)壁55和表面15。參看圖2B-C,合成聚合物涂層20可置于表面15或 側(cè)壁55上(或者,如上參看圖1所述,一個或多個中間層30可置于表面15或側(cè)壁55與合 成聚合物涂層20之間)或其一部分上。
[0038] 在各個實施方式中,制品100包括均勻涂覆的層20,其具有面積大于約5mm2的表 面25。當表面15的面積太小時,可靠的細胞響應不會容易觀察到,因為一些細胞如人類胚 胎干細胞作種為細胞群體或族(例如,具有約〇. 5_的直徑),并且需要合適的表面以確保 足量的群體的附著以產(chǎn)生定量的細胞響應。在大量的實施方式中,制品100具有井50,該井 具有均勾涂覆的表面15,其中表面15的面積大于約0. lcm2,大于約0. 3cm2,大于約0. 9cm2, 或者大于約lcm2。
[0039] 2.合成聚合物層的涂覆
[0040] 合成聚合物層可通過任何已知的或?qū)⒁_發(fā)的方法置于細胞培養(yǎng)制品的表面上。 較佳地,合成聚合物層提供了在一般的細胞培養(yǎng)條件下不會分層的均勻的層。合成聚合物 表面可通過共價或非共價相互作用與基底材料相連??蓪⒑铣删酆衔锉砻媾c基材連接的 非共價相互作用的例子包括化學吸附、氫鍵合、表面滲透、離子鍵合、范德華力、疏水相互作 用、偶極子-偶極子相互作用、機械互鎖及其組合。
[0041] 在各個實施方式中,所述基底材料基材表面根據(jù)共同待審的申請的教導來涂覆, 該申請?zhí)峤挥谕蝗掌?,發(fā)明人為Gohman等,代理人案卷號為20726,發(fā)明名稱為"干細胞 培養(yǎng)制品及篩選",其整體在本文中引用作為參考,前提是其不會與本發(fā)明沖突。
[0042] 在許多實施方式中,單體沉積在細胞培養(yǎng)制品的表面上并就地聚合。在這些實施 方式中,基底材料在本文中被稱為"基材",其上沉積有合成聚合物材料。聚合可在液相或體 相中進行。
[0043] 由于上表1中例舉的許多單體是粘性的,理想的是在分散在表面上之前,在合適 的溶劑中稀釋單體以降低粘度。降低粘度會允許形成合成聚合物材料的更薄、更均勻的層。 本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地選擇合適的溶劑。較佳地,所述溶劑與形成細胞培養(yǎng)制品和 單體的材料是相容的。理想的是選擇對要培養(yǎng)的細胞無毒并且不會干擾聚合反應的單體。 或者,理想的是選擇能夠基本上完全去除或者去除到無毒或不再干擾聚合的程度的溶劑。 在這些情況下,理想的是溶劑能夠容易地去除而無需苛刻的條件如真空或極熱??蓳]發(fā)的 溶劑是這些容易去除的溶劑的例子。
[0044] 適用于本文中描述的涂層制品用的各種條件的一些溶劑包括:乙醇、異丙醇、乙酸 乙酰酯、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)。如共同待審的申請中描述的,當需要在 聚合之前去除溶劑時,乙醇是特別合適的溶劑。
[0045] 所述單體可用溶劑來稀釋,通過合適量的溶劑達到所需的粘度和單體濃度。通常, 本發(fā)明中使用的單體組合物含有約1-99%的單體。舉例來說,單體可用乙醇溶劑稀釋以提 供具有約1-50%的單體,或者約1-10體積%的單體的組合物。單體可用溶劑稀釋,使得聚 合物層20達到所需的厚度。如上所述,如果沉積的單體太厚,會形成不均勻的表面。如實 施例中所進一步詳細描述的,當單體-溶劑組合物以大于約8微升/cm 2的表面15的體積沉 積在井50的表面15上時,可觀察到不均勻的表面。在各個實施方式中,單體-溶劑組合物 以等于或小于約7微升/cm 2的表面15的體積沉積在井50的表面15上。例如,單體-溶 劑組合物以等于或小于約5微升/cm2的表面15的體積沉積在井50的表面15上,或者等 于或小于約2微升/cm 2的表面15的體積沉積在井50的表面15上。
[0046] 在各個實施方式中,合成聚合物表面沉積在中間層的表面上,該中間層通過共價 或非共價相互作用,直接或者通過一個或多個附加的中間層(未示出)與基底材料連接。在 這些實施方式中,中間層在本文中被稱為"基材",其上沉積有合成聚合物表面。
[0047] 在各個實施方式中,處理基底材料的表面。表面可處理以改善合成聚合物表面對 基底材料表面的粘結(jié),以促進單體在基底材料表面上的擴散等。當然,基底材料可處理以達 到與中間層類似的目的。在各個實施方式中,表面是電暈放電處理或真空等離子體處理的。 可得自這些處理的高表面能可促進單體擴散和均勻涂覆。可使用的真空等離子體處理的例 子包括微波真空等離子體處理和射頻真空等離子體處理。所述真空等離子體處理可在反應 性氣體如氧氣、氮氣、氨或一氧化氮存在下進行。
[0048] 為了形成合成聚合物表面,聚合了上表1中存在的一種或多種單體。如果使用一 種單體,所述聚合物將被稱為單體的均聚物。如果使用兩種或更多種不同的單體,所述聚合 物將被稱為單體的共聚物。使用的單體可以是單官能的、二官能的或更高官能的。當使用 兩種或更多種單體時,可改變單體的比例。在不同的實施方式中,使用兩種單體,并且第一 種單體與第二種單體的體積比約為5:95至95: 5。例如,第一種單體與第二種單體的體積比 約為10:90至90:10,約為20:80至80:20,約為30:70至70:30。在一些實施方式中,第一 種單體與第二種單體的體積比約為50:50、30:70或10:90。要理解,聚合物的分子量可通過 改變單體的濃度或者二官能或更高官能的單體與單官能單體的比例來控制。二官能或更高 官能的單體的濃度增加會增加鏈中的交聯(lián)度。
[0049] 除了形成聚合物層的單體,形成所述層的組合物可包括一種或多種其它化合物, 如表面活性劑、濕潤劑、光引發(fā)劑、熱引發(fā)劑、催化劑、活化劑和交聯(lián)劑。<
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