阿魏酸酯酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種阿魏酸酯酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸酯酶（E. C. 3. I. 1. 73, Ferulicacid esterases, FAE)又稱肉桂酸酯酶。它 是一種羧酸酯酶，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿 魏酸游離出來的酶。阿魏酸在植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中起著重要的作用，它可以在植物細(xì)胞壁的 木質(zhì)素與木質(zhì)素之間、木質(zhì)素與半纖維素之間、半纖維素與半纖維素之間形成交接，從而 構(gòu)成一個(gè)骨架結(jié)構(gòu)，使得整個(gè)細(xì)胞壁變得堅(jiān)硬。在生物質(zhì)材料中阿魏酸主要以酯鍵的形式 連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上，構(gòu)成了木質(zhì)素和半纖維素的鏈接，形成了生物質(zhì) 材料的抗降解屏障。為了提高纖維素酶酶解生物質(zhì)的效率，需要額外補(bǔ)充添加阿魏酸酯酶。 阿魏酸酯酶處理植物性原料在食品、飼料和造紙工業(yè)中有著光明的前景。在食品工業(yè)中可 利用阿魏酸酯酶打斷阿魏酸與細(xì)胞壁材料如麩皮、秸桿中多糖的交聯(lián)，高效降解多糖并獲 得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶聯(lián)合作用的水解產(chǎn)物低聚糖（主要是低聚木糖）、阿 魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精發(fā)酵、生產(chǎn)木糖醇等。在飼料工業(yè)中， 利用阿魏酸酯酶處理植物性的原材料，可以將阿魏酸從植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游離出來，從 而破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，使得木質(zhì)素、半纖維素及纖維素之間的連接被部分打破，結(jié)構(gòu) 變得比處理前疏松，變得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高飼料的利用效 率。
[0003] 阿魏酸是天然抗氧化劑，也是近年來國際認(rèn)知的防癌物質(zhì)。其具有很好的抗氧化 活性，對過氧化氫、超氧自由基、羥自由基、過氧化亞硝基都有強(qiáng)烈的清除作用，且能調(diào)節(jié) 生理機(jī)能，抑制產(chǎn)生自由基的酶，增加清除自由基酶的活性。同時(shí)，阿魏酸可以作為合成 天然香蘭素的前體，以阿魏酸為原料，利用微生物的方法生產(chǎn)的香蘭素與合成的香蘭素相 比，具有毒性低，安全性高的特點(diǎn)，可以用作食品和化妝品行業(yè)的香料。阿魏酸廣泛存 在于食品原料中，目前已經(jīng)使用阿魏酸酯酶或與其他酶協(xié)同作用從各種農(nóng)作物的副產(chǎn)品 中如麥麩、玉米麩皮、啤酒糟、谷物纖維、甜菜渣、燕麥殼和蘋果渣等作為原材料來提取阿魏 酸。
[0004] 國外在阿魏酸酯酶的研究上已取得了一些卓有成效的工作。首先篩選了一批產(chǎn)阿 魏酸酯酶的微生物；其次對部分微生物產(chǎn)阿魏酸酯酶進(jìn)行了純化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了 研究，如酶的結(jié)構(gòu)、最適溫度、最適PH值及影響酶穩(wěn)定性的其他因素；第3探討了阿魏酸酯 酶與一些多糖降解酶的協(xié)同作用；第4探討了微生物產(chǎn)酶的影響因素和酶的工業(yè)化分離方 法。現(xiàn)在阿魏酸酯酶的酶活力，酶學(xué)特性仍然限制了它的應(yīng)用。迫切需要找到高酶活力的， 與纖維素酶協(xié)同作用強(qiáng)烈的新型阿魏酸酯酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是提供一種阿魏酸酯酶，其為由檜狀青霉表達(dá)獲得；
[0006] 本發(fā)明的目的之二是提供應(yīng)用阿魏酸酯酶進(jìn)行木質(zhì)纖維素降解的方法。
[0007] 本發(fā)明公開了一種阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0008] 優(yōu)選的是，其中，用于編碼所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基因序列為（a)或（b) 所示：
[0009] (a) SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)與（a)中多核苷酸序列根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0011] -種阿魏酸酯酶在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用。
[0012] -種應(yīng)用阿魏酸酯酶進(jìn)行木質(zhì)纖維素降解的方法，其特征在于，將所述阿魏酸酯 酶與纖維素酶混合后添加入水熱預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素溶液中進(jìn)行木質(zhì)素降解，其中，所 述阿魏酸酯酶的添加量為20 μ g-120 μ g/g底物，所述的纖維素酶的添加量為10FPU/g底 物。
[0013] 優(yōu)選的是，其中，將所述阿魏酸酯酶與纖維素酶混合后加入水熱預(yù)處理后的木質(zhì) 纖維素溶液中，在50°c下保溫進(jìn)行木質(zhì)素降解處理48h。
[0014] 優(yōu)選的是，其中，所述阿魏酸酯酶的添加量為66. 3 μ g/g底物。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明提供的阿魏酸酯酶的序列較新，與常見的黃曲霉、米曲霉的阿魏酸酯酶的 氨基酸序列相似度只有60% ;
[0017] 本發(fā)明提供的阿魏酸酯酶的新穎的酶學(xué)性質(zhì)：最適pH為3.0,偏酸性。最適溫度 為70°C，耐高溫；
[0018] 本發(fā)明提供的阿魏酸酯酶與商業(yè)纖維素酶復(fù)配后，對不同預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材 料都有促進(jìn)水解的作用，且在相同的水解條件下，相同時(shí)間內(nèi)水解效率明顯高于現(xiàn)有其他 種類的阿魏酸酯酶。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明所述阿魏酸酯酶的進(jìn)化樹；
[0020] 圖2為本發(fā)明中阿魏酸酯酶基因擴(kuò)增片段；
[0021] 圖3為本發(fā)明中阿魏酸酯酶_pET28a PCR驗(yàn)證的結(jié)果；
[0022] 圖4為本發(fā)明中阿魏酸酯酶_pET28a雙酶切驗(yàn)證的結(jié)果；
[0023] 圖5為本發(fā)明中阿魏酸酯酶在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)情況；
[0024] 圖6為本發(fā)明中異源表達(dá)的阿魏酸酯酶的分離純化結(jié)果；
[0025] 圖7為本發(fā)明中阿魏酸酯酶與纖維素酶協(xié)同作用結(jié)果，其中，底物分別為水解水 熱預(yù)處理的玉米秸桿，汽爆玉米秸桿和木薯酒糟；
[0026] 圖8為本發(fā)明中阿魏酸酯酶與纖維素酶協(xié)同作用結(jié)果，其中，底物為水解水熱預(yù) 處理的玉米秸桿；
[0027] 圖9為本發(fā)明中阿魏酸酯酶與纖維素酶協(xié)同作用結(jié)果，其中，底物為水解水熱預(yù) 處理的玉米秸桿。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0029] 應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術(shù)語并不配出一個(gè)或多 個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
[0030] 本發(fā)明提供了一種阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0031] -個(gè)優(yōu)選方案中，用于編碼所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基因序列為（a)或 (b)所示：
[0032] (a) SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列；
[0033] (b)與（a)中多核苷酸序列根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則互補(bǔ)的多核苷酸序列。
[0034] -種阿魏酸酯酶在木質(zhì)纖維素降解中的應(yīng)用。
[0035] -種應(yīng)用阿魏酸酯酶進(jìn)行木質(zhì)纖維素降解的方法，其特征在于，將所述阿魏酸酯 酶與纖維素酶混合后添加入水熱預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素溶液中進(jìn)行木質(zhì)素降解，其中，所 述阿魏酸酯酶的添加量為20 μ g-120 μ g/g底物，所述的纖維素酶的添加量為10FPU/g底 物。
[0036] -個(gè)優(yōu)選方案中，將所述阿魏酸酯酶與纖維素酶混合后加入水熱預(yù)處理后的木質(zhì) 纖維素溶液中，在50°C下保溫進(jìn)行木質(zhì)素降解處理48h。
[0037] -個(gè)優(yōu)選方案中，所述阿魏酸酯酶的添加量為66. 3 μ g/g底物。
[0038] 一、阿魏酸酯酶種類鑒定：
[0039] 如圖1所示，可以看到檜狀青霉的阿魏酸酯酶序列與黃曲霉，米曲霉的阿魏酸酯 酶相似度只有60%，該蛋白序列較新。
[0040] 二、阿魏酸酯酶的表達(dá)和分離純化：
[0041] 包括以下幾個(gè)部分：阿魏酸酯酶基因的擴(kuò)增，大腸桿菌系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建，大腸桿菌 中表達(dá)和阿魏酸酯酶蛋白的分離純化，具體為：
[0042] 1、阿魏酸酯酶基因的擴(kuò)增：
[0043] 我們首先培養(yǎng)檜狀青霉9-3菌株，采用天根植物總RNA提取試劑盒提取基因組 RNA 后，米用 Thermo fermentas 試劑盒 RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit K1621-1622進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA。根據(jù)FAE2基因序列設(shè)計(jì)帶有NheI酶切位點(diǎn)的上游 引物和帶有XhoI酶切位點(diǎn)的下游引物（上游引物序列為：FAE-S2,其多核苷酸序列為SEQ ID No. 3所示的多核苷酸序列，下游引物為：FAE-X2,其多核苷酸序列為SEQ ID No. 4所示 的多核苷酸序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到FAE2基因全長（1539bp)，如圖2所示。
[0044] 2、大腸桿菌系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建：
[0045] 得到FAE2片段后我們根據(jù)事先設(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)NheI和XhoI酶切FAE2片段回 收獲得兩端NheI和XhoI的粘性末端，同時(shí)采用NheI和XhoI雙酶切pET28a，膠回收獲得載 體片段，T4DNA Iigas酶連獲得重組載體FAE2-pET28a。獲得重組載體后分別進(jìn)行菌落PCR 和酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。
[0046] 由于FAE2基因和載體pET28a上都存在一個(gè)SmaI酶切位點(diǎn)，酶切之后產(chǎn)生4600bp 和2200bp的片段，因而我們采用SmaI酶切，結(jié)果如圖4所示。
[0047] 采用T7通用引物測序我們擴(kuò)增的DNA片段序列，DNAMN軟件進(jìn)行與阿魏酸酯 酶序列比對，發(fā)現(xiàn)相似度為100%，證明我們構(gòu)建的質(zhì)粒是正確的。得到正確的重組載體 FAE2-pET28a后，我們將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0048] 3、大腸桿菌