直投式凝乳酶制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種直投式凝乳酶制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]凝乳酶是乳酪生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，傳統(tǒng)上利用牛犢第四胃(皺胃)提取制作，隨著乳酪產(chǎn)業(yè)不斷擴(kuò)大，單純靠宰殺幼畜的方法來生產(chǎn)凝乳酶已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代工業(yè)對凝乳酶的需求。研究者已經(jīng)開始從其他動物、植物和微生物中尋求凝乳酶來源。微生物來源廣泛及其生長特性使得微生物凝乳酶具有廣闊的發(fā)展前景。目前關(guān)于微生物凝乳酶主要是利用真菌生產(chǎn)凝乳酶，而關(guān)于細(xì)菌生產(chǎn)的凝乳酶的研究較少。但細(xì)菌液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶具有生長周期短、生產(chǎn)成本低、易于控制生長條件等諸多優(yōu)點(diǎn)，近幾年得到研究者更多的關(guān)注。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]基于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種直投式凝乳酶制劑的制備方法。
[0004]實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的具體技術(shù)方案如下:
[0005]—種直投式凝乳酶制劑的制備方法，所述直投式凝乳酶制劑由保藏編號為CCTCCΜ 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)發(fā)酵培養(yǎng)制備得到，包括以下步驟:
[0006](1)格氏乳球菌的活化:將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)在瓊脂-營養(yǎng)肉湯斜面培養(yǎng)基上活化；
[0007](2)格氏乳球菌種子液的制備:將活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液；
[0008](3)格氏乳球菌的發(fā)酵培養(yǎng):將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0009](4)直投式凝乳酶制劑的制備:在步驟(3)的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入糖類保護(hù)劑，冷凍干燥，即得直投式凝乳酶制劑。
[0010]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:5?30wt%的脫脂乳，0?5*1:%的葡萄糖、乳糖、果糖或鹿糖，0?5*1:%的酵母粉、蛋白胨、氯化錢或硫酸錢，余為蒸飽水。
[0011]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:10wt%的脫脂乳，lwt %的葡萄糖，2wt %的蛋白胨，余量為蒸餾水。
[0012]在其中一些實(shí)施例中，步驟(1)所述瓊脂-營養(yǎng)肉湯斜面培養(yǎng)基中瓊脂的含量為2wt%，活化時間為20h?50h，溫度為25°C?48 °C。
[0013]在其中一些實(shí)施例中，步驟(2)所述培養(yǎng)基為M17培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為28 °C?48°C，培養(yǎng)時間為10h?50h，轉(zhuǎn)速為lOOrpm?280rpm。
[0014]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液按體積比為1%?10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28V ?48°C，時間為 24h ?156h，轉(zhuǎn)速為 lOOrpm ?280rpm。
[0015]在其中一些實(shí)施例中，步驟(3)將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液按體積比為1 %的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28°C，時間為144h，轉(zhuǎn)速為240rpm。
[0016]在其中一些實(shí)施例中，步驟(4)所述加入糖類保護(hù)劑為加入0.5?5被％的海藻糖和/或0.5?5wt%的乳糖，冷凍干燥的時間為20h?28h。
[0017]本發(fā)明的另一目的在于提供一種直投式凝乳酶制劑。
[0018]具體技術(shù)方案如下:
[0019]—種直投式凝乳酶制劑，由上述制備方法制備而得。
[0020]本發(fā)明的另一目的在于提供上述直投式凝乳酶制劑的應(yīng)用。
[0021]具體技術(shù)方案如下:
[0022]上述直投式凝乳酶制劑在制備發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)已于2015年10月22號保藏于武漢大學(xué)保藏中心中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址:武漢市武昌珞珈山)，保存期為三十年，保藏編號CCTCC Μ 2015633。
[0024]本發(fā)明篩選得到一種格氏乳球菌(Lactococcus garviea)，其保藏編號為CCTCC Μ2015633，進(jìn)而利用該格氏乳球菌(Lactococcus garviea)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)制備直投式凝乳酶制劑。本發(fā)明的直投式凝乳酶制劑的制備方法制備得到的凝乳酶制劑活性高(1230SU/mg以上)、熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性均很好，制備過程簡單、成本低。本發(fā)明的直投式凝乳酶制劑可用于制備發(fā)酵乳制品。
【附圖說明】
[0025]圖1為實(shí)施例1的直投式凝乳酶制劑的熱穩(wěn)定性研究圖。
[0026]圖2為實(shí)施例1的直投式凝乳酶制劑的酸堿穩(wěn)定性研究圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0028]以下實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按本領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)方法和條件進(jìn)行。格式乳球菌(Lactococcus garviea)保藏在武漢大學(xué)保藏中心中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏編號CCTCC M2015633。
[0029]實(shí)施例1
[0030]本實(shí)施例的一種直投式凝乳酶制劑的制備方法，包括以下步驟:
[0031](1)格氏乳球菌的活化:將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于2*1:%的瓊脂-營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行活化，活化溫度為28°C，時間為48h ;
[0032](2)格氏乳球菌種子液的制備:將活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于M17培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為28 °C，轉(zhuǎn)速為lOOrpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液；
[0033](3)格氏乳球菌的發(fā)酵培養(yǎng):將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液按體積比為1 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)144h，培養(yǎng)溫度為28°C，轉(zhuǎn)速為lOOrpm ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:10wt%的脫脂乳，lwt%的葡萄糖，2wt%蛋白胨，余量為蒸餾水；
[0034](4)直投式凝乳酶制劑的制備:在步驟(3)的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2wt%的海藻糖和
0.lwt%的乳糖，冷凍干燥24h，即得所述直投式凝乳酶制劑，其凝乳酶活性為1560SU/g。
[0035]凝乳酶活性測定方法:將直投式凝乳酶制劑用蒸餾水配制成10mg/mL的酶液。用
0.0lmol/L氯化鈣溶液配制12被％的脫脂奶粉溶液，室溫放置40min后使用，當(dāng)天配制。取5mL 12wt%的脫脂奶粉溶液在35°C水浴鍋中保溫lOmin，加0.05mL酶液，立即搖勻，開始計時，把試管傾斜45°，旋轉(zhuǎn)試管，觀察壁上出現(xiàn)絮狀沉淀時為凝乳終點(diǎn)，記錄凝乳時間。40min凝固lm L脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位(Soxhlet unit，SU)。按下式計算凝乳酶活力:MCE = 2400*V1*N/(T*V2)，式中:MCE為凝乳酶活力/(SU/mL) ;V1為脫脂奶粉溶液體積/mL ;t為凝乳時間/s ;V2為加酶體積/mL ;n為稀釋倍數(shù)。
[0036]實(shí)施例2
[0037](1)格氏乳球菌的活化:將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于2*1:%的瓊脂-營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行活化，活化溫度為45°C，時間為48h ;
[0038](2)格氏乳球菌種子液的制備:將活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于M17培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度為45 °C，轉(zhuǎn)速為240rpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液；
[0039](3)格氏乳球菌的發(fā)酵培養(yǎng):將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液按體積比為10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為45°C，轉(zhuǎn)速為240rpm ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:10wt%的脫脂乳，lwt%的葡萄糖，2wt%蛋白胨，余量為蒸餾水；
[0040](4)直投式凝乳酶制劑的制備:在步驟⑶的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入2被％的海藻糖和0.lwt%的乳糖，冷凍干燥24h，即得所述直投式凝乳酶制劑，其凝乳酶活性為1540SU/g，(測定方法同實(shí)施例1)。
[0041]實(shí)施例3
[0042](1)格氏乳球菌的活化:將格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于2*1:%的瓊脂-營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行活化，活化溫度為28°C，時間為24h ;
[0043](2)格氏乳球菌種子液的制備:將活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接種于M17培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為28 °C，轉(zhuǎn)速為240rpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)種子液；
[0044](3)格氏乳球菌的發(fā)酵培養(yǎng):將格氏乳球菌(Lactococcus