一種簡便的sds裂解制備細菌基因組dna懸液的方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法及應用。
【背景技術】
[0002]細菌分子鑒定技術中，16S rDNA序列的PCR擴增鑒定已經(jīng)是十分常用的手段。在實驗室的實際操作中，用于PCR擴增的模板DNA來源各異，比如試劑盒提取純化的DNA，或者是直接蘸取固體培養(yǎng)基上的單菌落菌體。但是前者的缺點是試劑繁多、步驟復雜，后者的缺點是平行組之間挑取的菌量不穩(wěn)定、未知細菌能否自裂解釋放DNA。
[0003]因此，尋找一種比較簡單快速、環(huán)境友好、同時能確保細菌裂解釋放出基因組DNA模板的制備方法，有利于提高細菌16S rDNA序列PCR的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服上述現(xiàn)有技術中存在的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備細菌基因組DNA懸液的方法PCR擴增鑒定(特別是16S rDNA序列的PCR擴增鑒定)中的應用。
[0006]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
[0007]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:一種簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法，其包括以下步驟:
[0008](1)細菌培養(yǎng):用試管裝入已滅菌的液體培養(yǎng)基1000mL，接種細菌，經(jīng)過夜培養(yǎng)12?16小時；
[0009](2)菌體收集:吸取1000 μ L細菌懸液12000rpm離心1分鐘沉淀菌體，并去除上清液；
[0010](3)菌體的裂解:往菌體沉淀加入10 μ L 0.1-10%的SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液，混勻后用渦旋振蕩器震蕩5分鐘；
[0011](4)稀釋裂解液:加入490 μ L的無菌水或者IXΤΕ溶液，吹打混勻，稍作離心，即可得到濃度適當，可直接用于PCR等基因操作的細菌基因組DNA模板懸液。
[0012]步驟(1)中所述的細菌為兼性厭氧菌或好氧細菌。
[0013]步驟⑴中所述的細菌為兼性厭氧菌時，采用靜置培養(yǎng)；所述的細菌為好氧細菌時，搖床培養(yǎng)。
[0014]上述方法制備獲得的細菌基因組DNA懸液可直接用于PCR的細菌DNA模板。每25 μ L PCR體系直接加入1?1.5 μ L細菌基因組DNA懸液作為反應模板。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)點:
[0016]本發(fā)明提供一種簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法，獲得細菌基因組DNA模板懸液，可直接用于PCR的細菌DNA模板；具體為每25 μ LPCR體系加入1?1.5 μ L細菌基因組DNA懸液作為反應模板即可；本發(fā)明所述的方法和應用極大的簡化了 PCR擴增鑒定(特別是16S rDNA序列的PCR擴增鑒定)，具有廣闊的市場應用前景。
【附圖說明】
[0017]圖1為PCR產(chǎn)物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，泳道1:DNAmarker2000，其中750bp條帶已知為20ng/ μ L ;泳道2:靜止培養(yǎng)12小時后的乳酸菌；泳道3:搖床培養(yǎng)12小時后的醋酸菌。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0019]實施例1
[0020](1)乳酸菌培養(yǎng):用試管裝入已滅菌的液體培養(yǎng)基1000mL，接種乳酸菌，采用靜置培養(yǎng)，經(jīng)過夜培養(yǎng)12?16小時；
[0021](2)菌體收集:吸取1000 μ L乳酸菌懸液至一新的離心管，然后12000rpm離心1分鐘沉淀菌體，并使用移液器去除上清液；
[0022](3)菌體的裂解:往菌體沉淀加入0.1-10% SDS溶液10 μ L，吹打混勻后，在渦旋振蕩器中震蕩5分鐘裂解乳酸菌；
[0023](4)稀釋裂解液:加入490 μ L的無酶無核酸的滅菌雙蒸水或者1 XΤΕ溶液，吹打混勻，獲得乳酸菌基因組DNA懸液。
[0024]上述方法制備獲得的乳酸菌基因組DNA懸液可直接用于PCR的乳酸菌DNA模板。每25 μ L PCR體系加入1.5 μ L上清液作為反應模板即可。
[0025]實施例2
[0026](1)醋酸菌培養(yǎng):用試管裝入已滅菌的液體培養(yǎng)基1000mL，接種醋酸菌，采用靜置培養(yǎng)，經(jīng)過夜培養(yǎng)12?16小時；
[0027](2)菌體收集:吸取1000 μ L醋酸菌懸液至一新的離心管，然后12000rpm離心1分鐘沉淀菌體，并使用移液器去除上清液；
[0028](3)菌體的裂解:往菌體沉淀加入0.1-10 % SDS溶液10 μ L，吹打混勻后，在渦旋振蕩器中震蕩5分鐘裂解醋酸菌；
[0029](4)稀釋裂解液:加入490 μ L的無酶無核酸的滅菌雙蒸水或者1 XΤΕ溶液，吹打混勻，獲得醋酸菌基因組DNA懸液。
[0030]上述方法制備獲得的醋酸菌基因組DNA懸液可直接用于PCR的醋酸菌DNA模板。每25 μ L PCR體系加入1.5 μ L上清液作為反應模板即可。
[0031]實施例1和實施例2中的PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示，該PCR反應采用細菌16S rDNA序列的通用引物27F和1492R，25yL的反應體系，添加了 1.5yL采用實施例1和實施例2制備的DNA模板；取2 μ L產(chǎn)物電泳，凝膠電泳結(jié)果顯示實施例1和實施例2制備獲得的細菌基因組DNA懸液作為PCR模板，可以擴增獲得清晰的目的基因條帶。
[0032]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)細菌培養(yǎng):用試管裝入已滅菌的液體培養(yǎng)基lOOOmL，接種細菌，經(jīng)過夜培養(yǎng)12?16小時； (2)菌體收集:吸取1000μ L細菌懸液12000rpm離心1分鐘沉淀菌體，并去除上清液； (3)菌體的裂解:往菌體沉淀加入10μ L 0.1-10%的SDS溶液，混勻后用渦旋振蕩器震蕩5分鐘； (4)稀釋裂解液:加入490μ L的無菌水或者1ΧΤΕ溶液，吹打混勻，稍作離心，即可獲得細菌基因組DNA懸液。2.根據(jù)權利要求1所述的簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的細菌為兼性厭氧菌或好氧細菌。3.根據(jù)權利要求1所述的簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法，其特征在于:步驟(1)中所述的細菌為兼性厭氧菌時，采用靜置培養(yǎng)；所述的細菌為好氧細菌時，搖床培養(yǎng)。4.權利要求1?3任一項所述的方法制備獲得的細菌基因組DNA懸液直接用于PCR的細菌DNA模板。5.根據(jù)權利要求4所述的方法制備獲得的細菌基因組DNA懸液直接用于PCR的細菌DNA模板，其特征在于:每25 μ L PCR體系直接加入1?1.5 μ L細菌基因組DNA懸液作為反應模板。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡便的SDS裂解制備細菌基因組DNA懸液的方法及應用，屬于生物技術領域。本發(fā)明的方法包括以下步驟：(1)細菌培養(yǎng)：用試管裝入已滅菌的液體培養(yǎng)基1000mL，接種細菌，經(jīng)過夜培養(yǎng)12～16小時；(2)菌體收集：吸取1000μL細菌懸液12000rpm離心1分鐘沉淀菌體，并去除上清液；(3)菌體的裂解：往菌體沉淀加入10μL？0.1-10％的SDS溶液，混勻后用渦旋振蕩器震蕩5分鐘；(4)稀釋裂解液：加入490μL的無菌水或者1×TE溶液，吹打混勻，稍作離心，即可獲得細菌基因組DNA懸液。本發(fā)明所述的方法和應用極大的簡化了PCR擴增鑒定，具有廣闊的市場應用前景。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/10, C12Q1/04
【公開號】CN105400774
【申請?zhí)枴緾N201511005071
【發(fā)明人】廖振林, 方祥, 李漢榮, 王麗, 鐘青萍
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年12月25日