CR5的細(xì)胞中。編輯CCR5基因能夠?qū)崿F(xiàn)CCR5基因表達(dá)的上 調(diào)、下調(diào)、或者喪失，優(yōu)選下調(diào)和喪失。所述細(xì)胞可以來源于靈長類動物，優(yōu)選來源于人。該 方法可以在體內(nèi)或體外實施。
[0036] 在第六方面中，本發(fā)明提供了第四方面所述的CRISPR_Cas9系統(tǒng)在制備用于預(yù)防 和/或治療HIV感染的藥物中的應(yīng)用。
[0037] 需要說明的是，本發(fā)明提供的各個sgRNA可以聯(lián)合使用，可以是任意兩種或多種 sgRNA的聯(lián)合使用，通過聯(lián)合使用，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以靶向多個位點，從而能夠更有效 地敲除CCR5基因。
[0038] 以下將通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù) 手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0039] 在以下實施例中，涉及的寡核苷酸序列委托金斯瑞生物科技有限公司合成得到。
[0040] 實施例1
[0041] 本實施例用來說明本發(fā)明的sgRNA的設(shè)計。
[0042] 根據(jù)5'-識別序列-招募Cas9蛋白的序列-3'和下表1所示的堿基序列構(gòu)建120 個 sgRNA。
[0043] 表 1
[0044]
[0045] 實施例2
[0046] 本實施例用來說明本發(fā)明的CRISPR_Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建。
[0047] (1)在SgRNA對應(yīng)的DNA序列（如實施例1所示）的5'末端加上CACC得到正向 寡核苷酸（Forward oligo)，根據(jù)此sgRNA，獲得其互補鏈，并且在其5'末端加上AAAC得到 反向寡核苷酸（Reverse oligo)。分別合成。如果SgRNA識別序列對應(yīng)的DNA序列5'末端 第一個堿基不為G，則需要在CACC之后加入一個G，相應(yīng)的在反向寡核苷酸的3'末端加入 一個匹配的C。將上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸成對變性、退火，退火后形成可以連入 U6真核表達(dá)載體中的雙鏈SgRNA寡聚核苷酸，變性、退火的體系為：
[0048] !μ! Forward oligo ( 100μΜ ) 1 μ] Reverse oligo ( 100μΜ ) ΙμL 1〇χΤ4 Ligation BuiVcr (NEB) (SlSiUl DNasc/RNasc-P>cc Water 0,5μ1 Τ4ΡΝΚ. (NEB M0201S)
[0049] PCR的條件為：37°C 30min ;95°C 5min ;然后以5°C /min的速率緩慢降溫至25°C ; 置于4°C下保存待用。
[0050] (2)對質(zhì)粒進(jìn)行BsmBI酶切和去磷酸化，反應(yīng)體系如下：
[0051] 5pg 質(zhì)粒（參見隨附的重組質(zhì)粒的序列設(shè)計） 3μΙ FastDIgcst BsmBl ( Fcnncnlas ) 3μ1 FaslAP ( Fcrrncntas ) 6μΙ IO^FaslDigcst BuiTcr 0.6μ1 IOOmMDTT (新鮮配制的) 添加 ddH_:0 個.60μ1
[0052] 37 °C孵育1小時，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用膠回收試劑盒（TIANGEN， DP080822)切膠回收酶切產(chǎn)物。
[0053] (3)退火后的雙鏈SgRNA寡聚核苷酸具有BsmBI的粘性末端，將其與被BsmBI酶切 過的質(zhì)粒進(jìn)行連接反應(yīng)，連接反應(yīng)的體系為：
[0054] ΧμL 酶切后的質(zhì)粒（50ng) ΙμL 按1:200稀釋的退火后的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸 5μ1 2xQuick Ligasc BuiTcr (NEB) jJII 人 DNasc/RNase-Free Water 卞.10μ1. ΙμΙ Quick Ligasc (NEB M2200S )
[0055] 16 °C孵育1小時。
[0056] (4)將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Stbl3感受態(tài)細(xì)胞（購自博邁德生物技術(shù)有限公司） 中，涂Amp+(100 μ g/ml)，挑取單克隆。
[0057] (5)通過PCR鑒定獲得陽性克隆，使用的引物如下：
[0058] Fl ：TCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG(SEQ ID NO:35)
[0059] Rl ：CCAATTCCCACTCCTTTCAAG(SEQ ID NO:36)
[0060] 反應(yīng)體系為：緩沖液，2. 5ul ;dNTP，2. 5ul ;ExTaq(TaKaRa)，0. 15ul ;稀釋菌液， Iul ;引物 F1/R1，0. 3ul ;ddH20，18. 25ul。
[0061] PCR 的條件為：37°C 30min ;94°C 5min ; (94°C 30s ;68°C 30s ;72°C 45s)22 個循環(huán)； 72°C 8min ;置于4°C下保存待用。
[0062] 測序驗證質(zhì)粒序列的正確性。
[0063] (6)37°C搖床過夜培養(yǎng)陽性克隆，并用質(zhì)粒小提試劑盒（TIANGE，DP106-02)抽提 質(zhì)粒，獲得表達(dá)sgRNA的重組質(zhì)粒U6-hCCR5sgRNA-EFla-Ne〇-WPRE (見圖1，其中一種的序列 如SEQ ID NO: 37所示，將SEQ ID NO: 37的第2857-2973位替換不同的sgRNA編碼序列可 以獲得表達(dá)實施例1中各個sgRNA的重組質(zhì)粒）、表達(dá)StCas9的重組質(zhì)粒U6-EFla-NLS-st Cas9-2A-Puro-WPRE(見圖2，其中一種的序列如SEQIDN0:38所示，將SEQIDN0:38的第 3815-8107位替換不同的Cas9編碼序列可以獲得表達(dá)不同Cas9的重組質(zhì)粒）以及共同表 達(dá) StCas9 和 sgRNA 的重組質(zhì)粒 U6-hCCR5sgRNA-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE (見 圖3,其中一種的序列如SEQ ID NO: 39所示，將SEQ ID NO: 39的第2857-2973位替換不同 的sgRNA編碼序列且第4172-8464位替換不同的Cas9編碼序列可以獲得表達(dá)實施例1中 的各個sgRNA和不同Cas9的重組質(zhì)粒）。
[0064] 實施例3
[0065] 本實施例用來說明使用本發(fā)明的CRISPR_Cas9系統(tǒng)編輯CCR5基因的方法。
[0066](一）細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
[0067] (1)將HEK293T細(xì)胞（CBR-130005,購自上海賽齊生物工程有限公司）在DMEM高 糖培養(yǎng)基（含有10%的？1^、青霉素化611；[0;[11;[11，1001]/1111)和鏈霉素（81:代。1:〇1115^;[11， 100μg/ml))中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0068] (2)轉(zhuǎn)染前分至六孔板中，細(xì)胞密度達(dá)70 %時進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
[0069] (3)按照 Lipofectamine 3000 (Invitrogen，11668-019)用量比例，使用 3 μ g 的 U 6-hCCR5sgRNA-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE、或者 L 5 μ g 的 U6-hCCR5sgRNA-EFla -Neo-WPRE 和 L 5 μ g 的 U6-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE 組合轉(zhuǎn)染每孔細(xì)胞，8h 后 換液，相應(yīng)的，加入噪呤霉素（Puromycin)和G418(Geneticin)進(jìn)行藥篩，48h后收取細(xì)胞。
[0070] (二）TA克隆測序檢測：
[0071] ⑴將收集的細(xì)胞在裂解液（10 μΜ Tris-HCl，0. 4M NaCl，2 μΜ EDTA，1% SDS)中， 用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到100 μ 1去離子水中；
[0072] (2)使用引物F2/R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用試劑盒（TIANGEN，DP080822)純化PCR回 收產(chǎn)物，其中，F(xiàn)2 :TCAATGTGAAGCAAATCGCAGCC(SEQ ID N0:40)，R2 :GATGGTGAAGATAAGCCTCA CAG(SEQ ID NO:41)；
[0073] (3)將獲得的PCR回收產(chǎn)物用rTaq進(jìn)行加 A反應(yīng)，體系為：
[0074] 80()ng PCR回收產(chǎn)物 5μ1 IOxBuiTcr ( ^ Mg2-) 3μ? Mg" 4μ1 dNTP 0.5μ! rTaq (TAKARA) 加入 CidH2O 到 50μΙ
[0075] 37°C溫浴30min，取1 μ 1產(chǎn)物與pMD19-T載體（TAKARA，3271)連接（連接方式參 見PMD19-T載體的說明書）并轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)胞（購自博邁德生物技術(shù)有限公司）。
[0076] (4)挑取單克隆進(jìn)行測序，根據(jù)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：祀基因 CCR5在sgRNA靶向的序列 處出現(xiàn)了缺失和插入（indel)，導(dǎo)致CCR5發(fā)生移碼突變，基因敲除成功。其中，針對識別序 列對應(yīng)的DNA序列為SEQ ID NO:22且招募Cas9蛋白的序列為SEQ ID NO:33的sgRNA處 理后的單克隆的測序結(jié)果如圖4所示（其中，箭頭表示Csa9切割位點，淺色部分為對HIV 天然免疫的人群中基因序列的缺失片段；隨機挑選50個克隆，一共檢測到9個克隆攜帶引 起移碼或者提前終止的突變，突變率為9/50 = 18% )。
[0077] 從以上實施例可以看出，本發(fā)明的CRISPR_Cas9系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)人CCR5基因的敲 除，且敲除效率也較高。
【主權(quán)項】
1. 一種CRISPR-Cas9系統(tǒng)識別的靶序列，其特征在于，所述靶序列如SEQIDNO: 1-30 中任意一個的第n-30位所示且η= 1-12。2. -種sgRNA，該sgRNA的序列為：5' -識別序列-招募Cas9蛋白的序列-3'，其特征 在于，所述識別序列對應(yīng)的DNA序列如SEQIDNO: 1-30中任意一個的第n-30位所示且η =1-12〇3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的sgRNA，其中，招募Cas9蛋白的序列如SEQIDΝ0:31-34所 不。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的sgRNA，其中，所述識別序列對應(yīng)的DNA序列如SEQID NO:22所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:33所示。5. 編碼權(quán)利要求2、3或4所述的sgRNA的DNA分子。6. -種CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其特征在于，該CRISPR-Cas9系統(tǒng)包括： Cas9蛋白和sgRNA，和/或 攜帶有Cas9蛋白的編碼序列和sgRNA的編碼序列的載體，所述Cas9蛋白的編碼序列 和sgRNA的編碼序列位于相同或不同的載體上， 其中，所述sgRNA為權(quán)利要求2、3或4所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)〇7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，其中，所述sgRNA為權(quán)利要求4所述的 sgRNA〇8. -種編輯CCR5基因的方法，其特征在于，該方法包括：將權(quán)利要求6或7所述的 CRISPR-Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入表達(dá)CCR5的細(xì)胞中。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述細(xì)胞來源于靈長類動物，優(yōu)選來源于人。10. 權(quán)利要求6或7所述的CRISPR-Cas9系統(tǒng)在制備用于預(yù)防和/或治療HIV感染的 藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了嗜熱鏈球菌CRISPR-Cas9系統(tǒng)識別的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其應(yīng)用，靶序列如SEQ？ID？NO:1-30中任一個第n-30位所示且n＝1-12。本發(fā)明還涉及序列為5’-識別序列-招募Cas9蛋白的序列-3’的sgRNA及其編碼DNA分子，識別序列對應(yīng)的DNA序列與靶序列相同。本發(fā)明還涉及CRISPR-Cas9系統(tǒng)，包括Cas9蛋白和sgRNA和/或攜帶有Cas9蛋白的編碼序列和sgRNA的編碼序列的載體。本發(fā)明還涉及CRISPR-Cas9系統(tǒng)在編輯CCR5基因和制備用于HIV感染的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明可以實現(xiàn)人CCR5基因的編輯，從而防治艾滋病。
【IPC分類】C12N9/22, C12N15/113, A61K31/7088, C12N15/11, A61P31/18
【公開號】CN105400779
【申請?zhí)枴緾N201510676703
【發(fā)明人】張競方, 秦小平
【申請人】蕪湖醫(yī)諾生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年10月15日