一種調(diào)控產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種調(diào)控產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的基因及其應(yīng)用，特別涉及一種反向調(diào)控產(chǎn)長(zhǎng) 鏈二元酸的基因及利用該基因構(gòu)建高產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸熱帶假絲酵母工程菌的方法，屬于生物 工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 長(zhǎng)鏈二元酸（Long-chain dicarboxylic acid，DCA)是指碳鏈中含有 10 個(gè)以 上碳原子的脂肪族二羧酸，包括飽和及不飽和二羧酸，是一類(lèi)有著重要和廣泛工業(yè)用途 的精細(xì)化工產(chǎn)品，是化學(xué)工業(yè)中合成高級(jí)香料、高性能尼龍工程塑料、高檔尼龍熱熔膠、 高溫電介質(zhì)、高級(jí)油漆和涂料、高級(jí)潤(rùn)滑油、耐寒性增塑劑、樹(shù)脂、醫(yī)藥和農(nóng)藥等的重要原 料。長(zhǎng)鏈二元酸在自然界中不單獨(dú)存在，同時(shí)由于生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二羧酸的有機(jī)合成法工藝復(fù) 雜、成本較高，有的二羧酸如十五碳二羧酸等尚無(wú)法合成，使得長(zhǎng)鏈二羧酸的開(kāi)發(fā)利用受 到限制。發(fā)酵法生產(chǎn)DCA是70年代興起的微生物發(fā)酵技術(shù)在石油化工領(lǐng)域的應(yīng)用，具有 原料來(lái)源廣、反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外受到普遍重視。生物法可提 供從C9到C18甚至C22的系列長(zhǎng)碳鏈二元酸單體，這些新型特種長(zhǎng)碳鏈二元酸單體可以 以更優(yōu)良的性能競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)法生產(chǎn)的已有長(zhǎng)碳鏈二元酸市場(chǎng)，同時(shí)，不同性質(zhì)的系列特種 長(zhǎng)碳鏈二元酸單體將會(huì)衍生一系列具有不同性質(zhì)的新功能材料，國(guó)內(nèi)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了以烷烴 為底物發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)碳鏈二元酸的產(chǎn)業(yè)化，生物法制備得到十一至十四碳二元酸已投放市 場(chǎng)。如中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1570124A(申請(qǐng)?zhí)?004100182557)、中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1844404A(申 請(qǐng)?zhí)?CN200610038331X)、中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn) CN101225411A(申請(qǐng)?zhí)?2007101958427)、中國(guó) 專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102115769A(申請(qǐng)?zhí)?009102565907)、中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102115768A(申請(qǐng) 號(hào) 2009102565890)、中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn) CN102115766A(申請(qǐng)?zhí)?2009102565871)、中國(guó)專(zhuān)利 文獻(xiàn)CN102115765A(申請(qǐng)?zhí)?009102565867)、中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102061316A(申請(qǐng)?zhí)?2010101603101)和中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn) CN103805642A(申請(qǐng)?zhí)?2012104397995)等。
[0003] 目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的技術(shù)特別是微生物育種方面日趨成熟，如 中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN103992959A(申請(qǐng)?zhí)?014101755564)通過(guò)增加一個(gè)拷貝的CYP單加 氧酶基因提高熱帶假絲酵母長(zhǎng)鏈二元酸的產(chǎn)率，中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN102839133A(申請(qǐng)?zhí)?CN201110168672X)則菌種誘變育種篩選到一株pox4基因、fao基因和CYP52A18基因的突 變株，突變株對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的烷烴、脂肪酸等物質(zhì)具有很高的轉(zhuǎn)化性能，雖然通過(guò)多種育 種手段二元酸生產(chǎn)微生物的產(chǎn)量有了一定程度的提升，但轉(zhuǎn)化率與理論轉(zhuǎn)化率相比依然還 有較大的提升空間，同時(shí)由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的主要菌種熱帶假絲酵母為二 倍體，因此通過(guò)傳統(tǒng)的誘變育種方式獲取高產(chǎn)率突變株難度較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種調(diào)控產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的基因及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0006] -種長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 pxalp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該基因來(lái) 源于熱帶假絲酵母，其表達(dá)可以反向調(diào)控長(zhǎng)鏈二元酸的轉(zhuǎn)化率。該序列第2110~4308bp 編碼732個(gè)氨基酸的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pxalp。
[0007] 上述長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 pxalp表達(dá)的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pxalp，氨基酸 序列如SEQ ID NO. 2所示。長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pxalp首先被轉(zhuǎn)運(yùn)到過(guò)氧化物酶體膜上， 與其它脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白結(jié)合形成多聚體后可以特異性的將位于細(xì)胞質(zhì)中的長(zhǎng)鏈脂肪 酸轉(zhuǎn)運(yùn)到過(guò)氧化物酶體中，并做為β -氧化作用的底物消耗掉。
[0008] 上述長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 pxalp在生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸中的應(yīng)用。
[0009] 上述應(yīng)用，通過(guò)基因工程手段對(duì)熱帶假絲酵母中的長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 pxalp進(jìn)行基因敲除，構(gòu)建熱帶假絲酵母基因工程重組菌，再利用熱帶假絲酵母基因工程重 組菌發(fā)酵生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸。
[0010] 對(duì)熱帶假絲酵母pxalp基因進(jìn)行基因敲除，可以減弱長(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至過(guò)氧化物 酶體內(nèi)進(jìn)行有氧氧化過(guò)程，使烷烴或油脂更多的進(jìn)入形成二元酸的轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而提高二 元酸轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述熱帶假絲酵母基因工程重組菌的發(fā)酵，步驟如下：
[0012] 將熱帶假絲酵母基因工程重組菌種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28~32°C條件下 培養(yǎng)12~14小時(shí)，然后調(diào)pH至7. 0~8. 0,接入油脂或烷烴進(jìn)入產(chǎn)酸期發(fā)酵，維持pH 7. 0~8. 0,每10~14小時(shí)流加葡萄糖溶液至發(fā)酵液中葡萄糖濃度為2. 5~20g/L，發(fā)酵產(chǎn) 酸4~5天，即得；
[0013] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：
[0014] 葡萄糖 40 ~60g/L、（NH4)2SO4O. 5 ~lg/L、玉米衆(zhòng) 1 ~2g/L、酵母膏 1 ~2g/L、 VB1O. 1 ~0· 2g/L、NaCl 1 ~2g/L、KH2P044 ~8g/L、Na2HP04 ·12Η20 5 ~10. 08g/L、尿素 2 ~ 3g/L、Mg2S04 ·7Η20 5 ~6. 15g/L、吐溫 600. 02 ~0· 5g/L、泡敵 3g/L，水配制，pH 6. 0 ~7. 0。
[0015] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述熱帶假絲酵母基因工程重組菌種子液采用如下方法制備：
[0016] 將熱帶假絲酵母基因工程重組菌接種于種子培養(yǎng)基中，28~32°C、200~250rpm 條件下培養(yǎng)14~16小時(shí)，制得熱帶假絲酵母基因工程重組菌種子液；
[0017] 所述種子培養(yǎng)基組分如下：
[0018] 酵母浸粉5~10g/L、蛋白胨10~20g/L、葡糖糖20~30g/L，水配制，pH自然。
[0019] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述調(diào)pH的pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉。
[0020] 上述熱帶假絲酵母基因工程重組菌的構(gòu)建方法，步驟如下：
[0021] (1)提取熱帶假絲酵母菌體的基因組DNA，以基因組DNA為模板，用引物Pxalpl-up 和Paxlpl-down進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備用于pxalp基因敲除的同源臂pxalpl ;
[0022] 所述的PCR引物核苷酸序列如下：
[0023] Pxalpl-up:GGAATTCCCTGCTTCTTATACCAATGCC
[0024] PaxIpI-down:ACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTGAGCAC
[0025] (2)提取pPIC9K質(zhì)粒，并以此為模板，使用引物Kan-up和Kan-down進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，得到G418抗性基因片段Kan ;
[0026] 所述的PCR引物序列如下：
[0027] Kan-up:GTGCTTAAATATACCTGGCTGGGGTTGAGGCCGTTG
[0028] Kan-down:CTTGCCGGGTCTTCTTTAGGGAATTCACTTGA
[0029] (3)將步驟⑴制得的用于pxalp基因敲除的同源臂pxalpl與步驟⑵制得的 G418抗性基因片段Kan進(jìn)行重疊 PCR，制得pxalpl-kan片段；
[0030] (4)以步驟（1)提取的基因組DNA為模板，使用引物Pxalp2-up和Pax2p2-down進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得到同源臂pxalp2 ;
[0031] Pxalp2-up:TCACTGTCCGACTTCAAGTGAATTCCCTAAAGAAGACC
[0032] Pax2p2-down:TTGATCACGCAAACTTCC
[0033] (5)將步驟（3)制得的pxalpl-kan片段與步驟⑷制得的同源臂pxalp2進(jìn)行重 疊 PCR，制得 pxalpl_kan-pxalp2 片段；
[0034] (6)將步驟（5)制得的pxalpl_kan_pxalp2片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切，轉(zhuǎn) 化熱帶假絲酵母，經(jīng)篩選，制得熱帶假絲酵母基因工程重組菌。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，所述的PCR擴(kuò)增體系為50μ1 :
[0036] 2XHiFi-PCR master 25 μ 1，濃度為 10 ymol/L 引物 Pxalpl-up 2. 5 μ 1，濃度為 10 μ mol/L 引物 Paxlpl-down 2· 5 μ 1，模板 2· 5 μ 1，用 ddH20 補(bǔ)足 50 μ I ;
[0037] 所述的PCR擴(kuò)增程序如下：
[0038] 95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 30sec，57°C退火 30sec，72°C延伸 I. 5min，30 個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 lOmin，-20°C保存。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（2)中，所述的PCR擴(kuò)增體系為50μ1 :
[0040] 2XHiFi-PCR master 25 μ 1，濃度為 10 ymol/L 引物 Kan-up 2.5 μ 1，濃度為 10 μ mol/L 引物 Kan-down 2. 5 μ 1，模板 2. 5 μ 1，用 ddH20 補(bǔ)足 50 μ 1 ;
[0041] 所述的PCR擴(kuò)增程序如下：
[0042] 95°C 預(yù)變性 5min ;95°C 變性 30sec，56°C 退火 30sec，72°C延伸 4min，30 個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 10min，-20°C保存。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（3)中，重疊 PCR的初次擴(kuò)增體系為25 μ 1 :
[0044] 用于pxalp基因敲除的同源臂pxalpl4 μ I ;G418抗性基因片段Kan 4 μ 1 ; 2XHiFi-PCR master 12. 5 μ I；ddH20 4.5 μ I ；
[0045] 所述的重疊 PCR的初次擴(kuò)增程序如下：
[0046] 95°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30sec，57°C退火 30sec，72°C延伸 I. 5min，5 個(gè)循環(huán)； 72°C 延伸 2min ;
[0047] 所述的重疊 PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增體系為25 μ 1 :
[0048] 濃度為10 μ mol/L的上游引物Pxalpl-up 2 μ 1 ;濃度為10 μ mol/L的下游引物 Kan-down 2 μ I ；2XHiFi-PCR master 12.5 μ I ；ddH20 8.5 μ I ；
[0049] 所述的重疊 PCR的補(bǔ)充擴(kuò)增程序如下：
[0050] 95°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 5min，30 個(gè)循環(huán)； 72°C延伸 10min，-20°C保存。
[0051] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（4)中，所述的PCR擴(kuò)增體