解除反饋抑制的thrA基因突變體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及解除反饋抑制的thrA基因突變體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇氨酸（L-Threonine)的化學(xué)名稱為α -氨基-β -羥基丁酸（a-amino-β _h ydroxybutyric acid)，是人體八種必需氨基酸之一。作為生物大分子的基本構(gòu)成元件，蘇 氨酸對(duì)人和動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)及健康具有重要的生理作用，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、以及醫(yī)藥行 業(yè)，是三大大宗發(fā)酵類氨基酸之一。近年來(lái)，蘇氨酸的市場(chǎng)需求量逐年增長(zhǎng)，其中飼料行業(yè) 對(duì)蘇氨酸的市場(chǎng)需求量最大。蘇氨酸作為安全性飼料添加劑，是繼賴氨酸之后的豬生長(zhǎng)的 第二限制氨基酸，并且是家禽生長(zhǎng)的第三限制氨基酸，僅次于賴氨酸和蛋氨酸。
[0003] 微生物發(fā)酵法是工業(yè)化生產(chǎn)蘇氨酸的主要方法。大腸桿菌從天冬氨酸合成蘇 氨酸共需要五步酶催化反應(yīng)，其中thrA基因編碼的雙功能酶天冬氨酸激酶I-高絲氨 酸脫氫酶I催化第一步和第三步反應(yīng)，是蘇氨酸合成的關(guān)鍵酶，該酶的活性受天冬氨 酸族氨基酸嚴(yán)格的調(diào)控。當(dāng)胞內(nèi)蘇氨酸積累到一定濃度時(shí)，會(huì)反饋抑制天冬氨酸激酶 的活性，從而限制蘇氨酸終端合成途徑的流量。因此，獲得解除反饋抑制的ThrA突變 體是實(shí)現(xiàn)菌種高效生產(chǎn)蘇氨酸的關(guān)鍵。過(guò)表達(dá)含有解除反饋抑制的thrA基因的蘇氨 酸操縱子，是提高大腸桿菌蘇氨酸合成途徑代謝流量的最基本和有效策略。例如，在 現(xiàn)有技術(shù)中，第1034位堿基突變?yōu)門的thrA基因是目前應(yīng)用廣泛的突變體，通過(guò)過(guò) 表達(dá)含有該突變體的蘇氨酸操縱子thrA ei°34TBC，可以顯著提高蘇氨酸及其衍生物的產(chǎn) 量[Mol Syst Biol，2007. 3:149;微生物學(xué)報(bào)，2009.49 (5) :591-596 ;Appl Microbiol Biotechnol, 2010. 88(4):905-913 ；Metabolic En gineering 2012, 14477 - 486 ；Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(14) :4886 ;中國(guó)專利，申請(qǐng)?zhí)?201410050917. 2]。雖然現(xiàn)有技 術(shù)中公布了多種解除反饋抑制的thrA基因突變體，但是以其為基礎(chǔ)構(gòu)建的工程菌的蘇氨 酸廣量仍具有很大的提尚空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了解除反饋抑制的thrA基因突變體及其應(yīng)用，獲得高效解除反饋抑 制的ThrA突變體，構(gòu)建了高效生產(chǎn)蘇氨酸的菌株，為改進(jìn)蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)提供了新途 徑。
[0005] 本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種解除反饋抑制的thrA基因突變體，所述thrA基因突 變體的基因序列為序列表SEQ ID NO :1的757-759位堿基突變?yōu)榻M氨酸密碼子的序列，所 述組氨酸密碼子包括CAU和CAC。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供一種蘇氨酸操縱子thrABC，其中，包含以上所述的 thrA基因突變體。
[0007] 以上所述的蘇氨酸操縱子thrABC，其中，所述蘇氨酸操縱子thrABC的啟動(dòng)子為強(qiáng) 啟動(dòng)子。
[0008] 以上所述的蘇氨酸操縱子thrABC，其中，所述強(qiáng)啟動(dòng)子包括以下啟動(dòng)子或其突變 體中的一種：L啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、T5啟動(dòng)子、Iac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子。
[0009] 本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種載體，其中，包含權(quán)利要求3所述的蘇氨酸操縱子 thrABC〇
[0010] 以上所述的載體，其中，為低拷貝、中拷貝或高拷貝數(shù)質(zhì)粒，優(yōu)選為包含以上所述 的蘇氨酸操縱子 thrABC 的 pSClOl、PACYC184、PBR322 或 pTrc99a。 toon] 本發(fā)明的另一個(gè)方面，一種重組菌，其中，所述重組菌含有以上所述的載體或所述 重組菌的染色體中整合有以上所述的蘇氨酸操縱子thrABC。
[0012] 以上所述的重組菌，其中，制備所述重組菌所用的底盤(pán)工程菌為敲除或弱化細(xì)菌 中以下基因的一個(gè)或多個(gè)獲得的菌株：編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶的metA基因、編碼蘇氨 酸脫氨酶的ilvA基因、編碼二氨基庚二酸脫羧酶的IysA基因、編碼蘇氨酸脫水酶的tdh基 因、編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的tdcC基因和編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的sstT基因；
[0013] 所述細(xì)菌為埃希氏菌屬細(xì)菌，更具體為大腸桿菌。如大腸桿菌K-12菌株的后續(xù)菌 株，包括W3110及其衍生的菌株。
[0014] 本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種過(guò)表達(dá)蘇氨酸操縱子thrABC的方法，其中，包括 將強(qiáng)啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的以上所述的蘇氨酸操縱子thrABC插入表達(dá)載體中得到重組載體， 并將所述重組載體轉(zhuǎn)化至底盤(pán)工程菌中；或?qū)?qiáng)啟動(dòng)子調(diào)控的以上所述的蘇氨酸操縱子 thrABC整合至底盤(pán)工程菌的染色體中。
[0015] 本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供一種發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸的方法，其中，包括如下步驟：發(fā) 酵培養(yǎng)以上所述的重組菌，收集發(fā)酵產(chǎn)物的上清液，得到蘇氨酸。
[0016] 通常將獲得的目的基因和載體通過(guò)限制內(nèi)切酶酶切和T4連接酶連接的方式構(gòu)建 重組載體。重組載體可以通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常規(guī)的氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化或電穿孔轉(zhuǎn)化的方 法轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，可獲得重組菌。
[0017] 用于重組菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基可以是豐富培養(yǎng)基，也可以是無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。培養(yǎng)基包 含碳源、氮源、無(wú)機(jī)離子、抗生素和其它的營(yíng)養(yǎng)因子。作為碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳 糖等糖類；也可以是甘油、甘露醇等醇類；也可以使用葡萄糖酸、檸檬酸、丁二酸等有機(jī)酸 類。作為氮源，可以使用氨水、硫酸銨、磷酸銨、氯化銨等無(wú)機(jī)氮源；也可以使用玉米漿、豆柏 水解液、毛發(fā)粉、酵母提取物、蛋白胨等有機(jī)氮源。無(wú)機(jī)離子包含鐵、鈣、鎂、錳、鉬、鈷、銅、鉀 等離子中的一種或多種。其它營(yíng)養(yǎng)因子還包括生物素、維生素 B1、吡哆醛等維生素。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于，獲得了一種高效解除反饋抑制的ThrA突變體，過(guò)表達(dá)包 含該突變體的蘇氨酸操縱子的工程菌可以顯著提高蘇氨酸產(chǎn)量。本發(fā)明中的ThrA突變體 在實(shí)踐上可用于細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)蘇氨酸，使用過(guò)表達(dá)包含該突變體的蘇氨酸操縱子的菌種在 發(fā)酵罐發(fā)酵20-40小時(shí)，蘇氨酸產(chǎn)量可以達(dá)到50-200g/L，質(zhì)量轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到30 % -65 %。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖 1 表達(dá)載體 pACYC184-PP「thrA*BC 的圖譜；
[0020] 圖 2 染色體整合載體 pKOV-UPtdcC-PPL-thrA*BC-DowntdcJ^ 圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明，以便能 夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以下描述的【具體實(shí)施方式】和實(shí) 施例僅是說(shuō)明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0022] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0023] 下述實(shí)施例中如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）》（科學(xué)出版 社）、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（第4版）》（高等教育出版社）以及相應(yīng)儀器和試劑的廠商說(shuō)明書(shū)等 參考。
[0024] 實(shí)施例 1、底盤(pán)工程菌 E. coli K-12 W3110 Δ metA Δ ilvA Δ IysA Δ tdh Δ tdc C Δ sstT的構(gòu)建
[0025] 在 E. coli K12 W3110 的基礎(chǔ)上依次敲除 metA、ilvA、lysA、tdh、tdc C、sstT 基 因，用于基因敲除的引物序列如表1所示，最終獲得底盤(pán)工程菌E. coli K-12 W3110AmetA Λ ilvA Λ IysA Λ tdh Λ tdcC Λ sstT。具體步驟如下：
[0026] DmetA基因敲除
[0027] 以E.coli K12 W3110菌株（可購(gòu)自日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心（NITE Biological Resource Center，NBRC))的基因組 DNA 為模板，分別以 WY569 和 WY570、WY571 和WY572為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到503bp的metA上游區(qū)域和473bp的metA下游區(qū)域兩 條DNA片段，再以這兩條DNA片段混合為模板，以WY569和WY572為引物，通過(guò)Overlap PCR 擴(kuò)增，得到976bp Overlap PCR連接片段；再將Overlap PCR連接片段和pKOV質(zhì)粒（可購(gòu) 自Addgene公司）連接，得到重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入待敲除菌株E. coli K12 W3110中，得到metA 基因敲除的菌株E.coli K12W311〇AmetA;
[0028] 使用metA基因外側(cè)序列引物WY583和WY584菌落PCR驗(yàn)證基因敲除，1375bp的條 帶為陽(yáng)性。具體方法如下：
[0029] 以抽提的野生型大腸桿菌E. coli K12 W3110菌株基因組DNA為模板，分別以 WY569和WY570、WY571和WY572為引物，使用EX Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR按如下方 式進(jìn)