一種增強(qiáng)絨毛白蠟?zāi)望}性的FvNCED3基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)絨毛白蠟?zāi)望}性的FVNCED3基因及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 絨毛白錯(cuò)（Fraxinus velutina Torr.)是優(yōu)良的鹽堿地造林綠化和城市園林綠化 樹(shù)種，也是常用的固沙樹(shù)種，具有耐鹽、抗旱、耐寒及抗病蟲(chóng)害等優(yōu)點(diǎn)，是重要的林木種質(zhì)資 源。但目前有關(guān)絨毛白蠟?zāi)湍娣肿訖C(jī)制的研究鮮有報(bào)道，從中分離得到的天然優(yōu)良基因更 少，其大部分基因的功能仍處于未知狀態(tài)。因此，有必要加強(qiáng)對(duì)絨毛白蠟等代表性木本植物 的分子生物學(xué)研究，挖掘其中的關(guān)鍵耐逆基因，從而為植物耐逆性狀的遺傳改良提供理論 依據(jù)及新的基因資源。
[0003] 脫落酸（ABA)是一種重要的植物激素，在鹽脅迫響應(yīng)中具有重要作用。鹽脅迫引 起的植物內(nèi)源ABA水平的提高，是植物對(duì)外界環(huán)境刺激積極適應(yīng)的表現(xiàn)，這是因?yàn)锳BA不僅 可作為細(xì)胞信號(hào)物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉以降低蒸騰作用來(lái)介導(dǎo)植株的耐鹽響應(yīng)，還可作為 系統(tǒng)逆境信號(hào)誘導(dǎo)許多抗逆基因的表達(dá)，近而發(fā)揮其耐鹽調(diào)控作用。ABA通過(guò)上述途徑誘導(dǎo) 植物向耐鹽代謝調(diào)節(jié)途徑轉(zhuǎn)化，最終增強(qiáng)植物對(duì)外界鹽脅迫的適應(yīng)性。因此關(guān)于ABA與植 物耐鹽性關(guān)系的研究一直是植物耐鹽機(jī)制研究中的熱點(diǎn)之一。
[0004] ABA可參與調(diào)控植物對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答，目前通過(guò)多種途徑證實(shí)了 ABA在高 鹽引起的滲透脅迫中的重要調(diào)控作用。鹽脅迫下，植物體內(nèi)ABA含量增加，鹽脅迫誘導(dǎo)ABA 合成主要通過(guò)調(diào)節(jié)ABA合成基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)實(shí)現(xiàn)，高鹽環(huán)境誘導(dǎo)ABA合成相關(guān)基因的表 達(dá)量上調(diào)，從而大量合成ABA促進(jìn)植物對(duì)外界脅迫的適應(yīng)。對(duì)耐鹽性不同的植物，如棉花、 大麥、番茄等的研究表明，ABA可調(diào)節(jié)這些植物對(duì)長(zhǎng)期鹽脅迫的適應(yīng)性，且外施ABA可增強(qiáng) 植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。此外，對(duì)擬南芥abal、aba2、aba3突變體的研究發(fā)現(xiàn)，高鹽處理下， 上述ABA缺失突變體比野生型植株更容易枯萎和死亡，而擬南芥超敏感突變體eral對(duì)高鹽 干旱等脅迫的抗性增強(qiáng)。上述研究表明了 ABA在植物耐鹽調(diào)控中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用，因此 進(jìn)一步加強(qiáng)木本植物中ABA信號(hào)通路相關(guān)基因克隆及功能研究尤為必要。
[0005] 鹽脅迫會(huì)引起一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，其中ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在鹽脅迫的應(yīng)答反 應(yīng)中起關(guān)鍵作用。通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，ABA可誘導(dǎo)一系列與鹽脅迫相關(guān)基因的表達(dá) 來(lái)增強(qiáng)植物的耐鹽性，其中一類(lèi)為離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因、滲透調(diào)芐基因、晚期胚胎豐富蛋白基因以 及抗氧化物酶等功能基因，另一類(lèi)為轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶等調(diào)控基因。許多鹽 脅迫應(yīng)答基因受ABA的調(diào)控而表達(dá)，屬于ABA依賴(lài)型脅迫應(yīng)答基因。目前發(fā)現(xiàn)的ABA誘導(dǎo) 所必需的順式調(diào)控序列主要包括：ABRE元件，CE3序列，RY/Sph元件及MYB和MYC識(shí)別序 列。此外，擬南芥中還發(fā)現(xiàn)了許多與ABA信號(hào)途徑有關(guān)的基因，如AREB、SnRK2、PP2C、ABIl、 ABI2、RD29等。其中AREB/ABFs是一類(lèi)ABRE結(jié)合蛋白-bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，而SnRK2和PP2C 在ABA信號(hào)途徑中則分別作為正向和反向調(diào)控因子發(fā)揮作用。結(jié)合上述研究基礎(chǔ)，分析轉(zhuǎn) 基因植株中ABA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)變化對(duì)于揭示絨毛白蠟NCED基因在ABA信號(hào)途 徑中的作用及其耐鹽機(jī)制具有重要的研究意義。
[0006] ABA生物合成是ABA信號(hào)產(chǎn)生的基礎(chǔ)，其中NCED是ABA生物合成的關(guān)鍵限速酶， 因此ABA合成關(guān)鍵酶基因 NCED的啟動(dòng)是操縱ABA信號(hào)產(chǎn)生的重要機(jī)制。鑒于NCED在ABA 合成途徑中的關(guān)鍵作用，因此克隆和分析與耐鹽相關(guān)的各類(lèi)NCED基因一直是植物耐鹽分 子研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前已在多種植物中發(fā)現(xiàn)了參與調(diào)控植物耐鹽性的NCED基因。 草本植物中，擬南芥的AtNCED3和柱花草SgNCED均可受高鹽等脅迫條件誘導(dǎo)，其中過(guò)表達(dá) AtNCED3可使擬南芥內(nèi)源ABA水平提高，且轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出呼吸速率降低等耐鹽性狀；而 過(guò)表達(dá)SgNCED的轉(zhuǎn)基因煙草則是通過(guò)增加內(nèi)源ABA、H 202、NO以及抗氧化酶的表達(dá)水平來(lái)增 強(qiáng)植物耐鹽等性狀。此外，在藏紅花中也發(fā)現(xiàn)了與調(diào)控植物耐鹽抗旱等性狀相關(guān)的CstNCED 基因。近來(lái)有關(guān)NCED基因在木本植物中的耐鹽調(diào)控研究也受到了人們的關(guān)注。其中海棠 MhNCED3基因可被高鹽等脅迫誘導(dǎo)，其內(nèi)源ABA含量與基因表達(dá)呈正相關(guān)，過(guò)表達(dá)及恢復(fù)實(shí) 驗(yàn)表明該基因具有調(diào)控植物耐鹽方面的功能。而柑橘中受ABA等多種脅迫誘導(dǎo)的CrNCEDl 基因不僅可降低轉(zhuǎn)基因煙草中H2O2和O2的含量，還可顯著上調(diào)參與ROS清除以及維持水分 平衡相關(guān)基因（NtCAT、NtSOD、NtP5CS、NtLEA5、NtERDlOC)的表達(dá)，從而使植株表現(xiàn)出較強(qiáng) 的耐鹽抗旱等特性。從上述NCED基因通過(guò)調(diào)控ABA的合成來(lái)增強(qiáng)植物的耐鹽性研究來(lái)看， 利用基因工程手段導(dǎo)入各類(lèi)NCED基因?qū)⒊蔀樵鰪?qiáng)植物耐逆性的有效途徑之一。
[0007] 上述研究結(jié)果表明，9'-順環(huán)氧類(lèi)胡蘿卜素雙加氧化酶（NCED)作為調(diào)節(jié)ABA生物 合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，通過(guò)提高該類(lèi)NCED基因的表達(dá)水平可增強(qiáng)植物的耐鹽抗旱等 抗逆能力。但目前未見(jiàn)有關(guān)絨毛白蠟ABA生物合成途徑及相關(guān)合成基因 NCED的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種增強(qiáng)絨毛白蠟?zāi)望}性的FvNCED3基因及其 應(yīng)用。
[0009] 一種增強(qiáng)絨毛白蠟?zāi)望}性的FvNCED3基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0010] 一種由上述FvNCED3基因編碼的多肽，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 一種插入上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的載體。
[0012] 一種重組細(xì)胞，插入了上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序 列的載體。
[0013] 上述FvNCED3基因、載體或重組細(xì)胞在經(jīng)濟(jì)作物生產(chǎn)改良中的應(yīng)用。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明首次從絨毛白蠟中發(fā)現(xiàn)了與增強(qiáng)植物耐鹽性相關(guān)的絨毛白蠟FvNCED3基 因，qRT-PCR方法分析表明在200mM NaCl脅迫處理下，F(xiàn)vNCED3在24h時(shí)表達(dá)量最高； 且FvNCED3基因的過(guò)量表達(dá)植株較野生型表現(xiàn)出較好的耐鹽性。經(jīng)試驗(yàn)證明絨毛白蠟 FvNCED3基因具有巨大的應(yīng)用前景，尤其對(duì)于基因工程改良植物的耐逆性具有巨大的潛在 應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為研究整個(gè)植物抗逆基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及脅迫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，為 利用植物基因工程的方法改良作物抗逆性，創(chuàng)造新的抗逆樹(shù)種提供基因基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是絨毛白蠟FvNCED3的進(jìn)化樹(shù)分析圖；
[0017] 圖2是絨毛白蠟FvNCED3基因在鹽脅迫處理下的表達(dá)模式qRT-PCR分析圖；
[0018] 圖3是轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)電泳圖；
[0019] 其中：M、DL2000 ;1-8、FvNCED3轉(zhuǎn)基因植株；9、野生型植株。
[0020] 圖4是FvNCED3轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫下的根長(zhǎng)及鮮重圖；
[0021] 其中：WT、野生型對(duì)照；0E2,0E5,0E7 :轉(zhuǎn)基因植株*表示差異達(dá)0. 05顯著水平，** 表示差異達(dá)0.01顯著水平。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例及說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述，但本發(fā)明所保 護(hù)范圍不限于此。
[0023] 實(shí)施例
[0024] 1、實(shí)驗(yàn)方法與步驟
[0025] I. 1材料的處理
[0026] 以播種于相同基質(zhì)中且長(zhǎng)勢(shì)一致的苗齡為1個(gè)月的絨毛白蠟幼苗為材料。分別用 200mM NaCl處理絨毛白蠟幼苗他，1211，2411，4811，每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。熒光定量？0?法進(jìn) 行基因表達(dá)模式分析，2 Λ 法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0027] 1.2基因的克隆
[0028] 分別稱(chēng)取上述處理好的材料IOmg放在液氮預(yù)冷過(guò)的研缽中充分研磨至粉末狀； 將研磨好的粉末移入加有提取液的1.5ml離心管。然后按照E.Z.N. A Total RNA Kit試劑 盒說(shuō)明書(shū)的操作要求分別提取上述處理好的絨毛白蠟各組織的總RNA。之后配制1.2wt% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的RNA的完整性。
[0029] 利用3' RACE方法擴(kuò)增FvNCED3基因的cDNA序列。具體操作方法如下：
[0030] 將mRNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，使用Takara公司3' -Full Race試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄，反應(yīng)體系為10 μ 1。
[0031] 依次加入：
[0032] Total RNA (1 μ g/μ 1) 5. 5 μ 1，3' Race adaptor 1 μ