基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾β -Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因以及其中的致死基因片段和該致死基因片段的dsRNA與dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在我國(guó)，化學(xué)藥劑連續(xù)單一長(zhǎng)期使用已導(dǎo)致昆蟲(chóng)對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性，需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達(dá)到滿意的防治效果，造成了更為嚴(yán)重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。另外舞毒蛾還會(huì)影響人類(lèi)健康，當(dāng)人們直接接觸舞毒蛾時(shí)，常會(huì)發(fā)生紅腫發(fā)癢現(xiàn)象，嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生皮疹。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，急需化學(xué)農(nóng)藥之外的替代防治手段。
[0003]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過(guò)序列配對(duì)的方式與蛋白編碼基因結(jié)合，根據(jù)序列配對(duì)的程度降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過(guò)程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動(dòng)物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理獎(jiǎng)。
[0004]在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術(shù)將農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)中重要基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，則會(huì)引起害蟲(chóng)的致畸或致死，從而達(dá)到控制害蟲(chóng)的目的。
[0005]幾丁質(zhì)降解和代謝是昆蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類(lèi)和其他高等動(dòng)物體內(nèi)不含幾丁質(zhì)，因此昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲(chóng)劑作用的靶標(biāo)。乙酰葡萄糖胺糖苷酶在昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)的降解過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開(kāi)展乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的dsRNA在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾β -Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因以及其中的致死基因片段和該致死基因片段的dsRNA與dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因ZoNagl，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述ZoNagl基因是從舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的，其長(zhǎng)度為182lbp，編碼607個(gè)氨基酸。
[0008]另外，本發(fā)明提供了一種舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZoNag2，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]進(jìn)一步，本發(fā)明提供了上述舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZoNag2的合成方法，其步驟為:根據(jù)所述ZoNagl的核苷酸序列，以序列SEQ ID N0.3為上游引物、序列SEQ ID勵(lì).4為下游引物，將^0^81的重組pEASY_Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得ZoNag2。
[0010]然后，本發(fā)明進(jìn)一步利用相關(guān)試劑盒合成dsRNA，并且提供了該dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用:注射dsRNA到舞毒蛾體腔。結(jié)果表明:dsRNA可以特異性的沉默β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的mRNA表達(dá)，舞毒蛾因蛻皮困難死亡。
[0011]本發(fā)明根據(jù)舞毒蛾β -Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因ZAagl獲得了致死基因片段XoNag2,以及該致死基因片段ZoNag2的dsRNA，利用dsRNA能夠達(dá)到控制害蟲(chóng)的目的，有望減少農(nóng)藥的大量使用，保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)收益，具有市場(chǎng)應(yīng)用前景，為安全無(wú)公害的害蟲(chóng)防治方法的研制提供了新途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為預(yù)蛹期舞毒蛾幼蟲(chóng)注射dsRNA和DEPC處理水后對(duì)舞毒蛾生長(zhǎng)發(fā)育的影響對(duì)比圖。結(jié)果表明:注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組(A)出現(xiàn)蛻皮困難無(wú)法化為蛹而死亡的表型，注射DEPC處理水的對(duì)照組(B)發(fā)育正常。
[0013]圖2為采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究預(yù)蛹期舞毒蛾幼蟲(chóng)注射dsRNA后ZoNag2的相對(duì)表達(dá)量對(duì)比圖。圖中:1表示對(duì)照組的預(yù)蛹期幼蟲(chóng)；2表示注射ZoNag2的dsRNA的預(yù)蛹期幼蟲(chóng)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1:舞毒蛾β -Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZoNag2的獲得
根據(jù)從舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的舞毒蛾β_Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因ZAagl的核苷酸序列，采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性的引物，上游引物序列為SEQ IDN0.3，下游引物序列為SEQ ID N0.4，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。將成功獲得的舞毒蛾β_Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因ZoNagl的重組pEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得致死基因片段ZoNag2，使用MicroElute Cycle Pure Kit (OMEGA)試劑盒進(jìn)行純化。
[0015]實(shí)施例2:舞毒蛾β -Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZoNag2的dsRNA的獲得
用實(shí)施例1獲得的舞毒蛾β_Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZAag〗，按照T7RiboMAX? Express RNAi System(Promega)試劑盒說(shuō)明書(shū)，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其單一性，用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific MultiskanG0，Thermo Fisher Scientific，USA)檢測(cè)其濃度，并濃縮至終濃度lPg/gl保存至_80°C
備用ο
[0016]實(shí)施例3:舞毒蛾β -Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZoNag2的dsRNA的致死舞毒蛾實(shí)驗(yàn)
1)舞毒蛾β -Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZoNag2的dsRNA注射選取預(yù)蛹期幼蟲(chóng)用于注射上述合成的dsRNA。5ul規(guī)格的微量注射器用于注射，注射時(shí)不可用力過(guò)大，側(cè)腹部作為注射點(diǎn)，注意避開(kāi)氣門(mén)。注射dsRNA的量為5Pg，并設(shè)置注射等量的DEPC處理水的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各20頭。注射完畢后，將幼蟲(chóng)放置于生化培養(yǎng)箱中用購(gòu)自中國(guó)林科院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所業(yè)進(jìn)行飼養(yǎng)(光照:黑暗時(shí)間=16h:8h，溫度 26±1°C，濕度 70%) ο
[0017]2)注入dsRNA后舞毒蛾表型的觀察
幼蟲(chóng)注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時(shí)地觀察。注射dsRNA舞毒蛾的實(shí)驗(yàn)組有部分幼蟲(chóng)因無(wú)法蛻蛹化為成蟲(chóng)而死亡。
[0018]3)注入dsRNA后舞毒蛾死亡情況的觀察
注射dsRNA的舞毒蛾實(shí)驗(yàn)組死亡率為25%，這與注射DEPC處理的對(duì)照組(死亡率為
1.67%)相比，致死效果明顯。通過(guò)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究表明注射dsRNA的舞毒蛾實(shí)驗(yàn)組預(yù)蛹期幼蟲(chóng)體內(nèi)β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的相對(duì)表達(dá)量明顯降低。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因ZoNagl，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段ZAag〗，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。3.權(quán)利要求2所述舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段L—g2的合成方法，其特征在于，其步驟為:根據(jù)權(quán)利要求1所述ZoNagl的核苷酸序列，以序列SEQ ID N0.3為上游引物、序列SEQ ID N0.4為下游引物，將ZONagl的重組pEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得ZoNag2。4.權(quán)利要求2所述舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段L—gl的dsRNA。5.權(quán)利要求4所述舞毒蛾β-Ν-乙酰葡萄糖胺糖苷酶致死基因片段的dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因以及其中的致死基因片段和該致死基因片段的dsRNA與dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)舞毒蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因<i>Ld</i>Nag1獲得了致死基因片段<i>Ld</i>Nag2，以及該致死基因片段<i>Ld</i>Nag2的dsRNA，利用dsRNA能夠達(dá)到控制害蟲(chóng)的目的，有望減少農(nóng)藥的大量使用，保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)收益，具有市場(chǎng)應(yīng)用前景，為安全無(wú)公害的害蟲(chóng)防治方法的研制提供了新途徑。
【IPC分類(lèi)】A01N57/16, C12N15/10, A01P7/04, C12N15/56, C12N15/113
【公開(kāi)號(hào)】CN105400807
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510974582
【發(fā)明人】范曉軍, 張建棟, 楊春, 劉建紅, 李瑤
【申請(qǐng)人】太原理工大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月23日