利用生殖特異性啟動(dòng)子表達(dá)cre的重組酶載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 利用Cre/loxP系統(tǒng)進(jìn)行條件性基因敲除是目前最有效，也是最具發(fā)展前景的基 因修飾策略。在過去的30年里，以小鼠為載體，利用Cre/loxP系統(tǒng)進(jìn)行基因功能研究取得 了非常顯著的成果。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，利用Cre/loxP系統(tǒng)構(gòu)建條件性基因敲除動(dòng)物 模型將成為活體內(nèi)研究基因功能的強(qiáng)大工具，也使得基因功能的研究更全面，更準(zhǔn)確。
[0003] 用基因敲除技術(shù)構(gòu)建的人類疾病的小鼠模型能夠很好地模仿人類疾病的發(fā)生發(fā) 展特征，為人類疾病研究提供了可靠的工具，在腫瘤研究、藥物篩選等方面應(yīng)用十分廣泛。 不過，小鼠作為嚙齒類動(dòng)物，與哺乳動(dòng)物在基因組特點(diǎn)、組織結(jié)構(gòu)、器官大小等方面存在比 較大的差別，因此小鼠動(dòng)物模型在某些方面并不能非常準(zhǔn)確地為人類研究提供工具。與小 鼠相比，豬作為哺乳動(dòng)物，在基因組水平、器官結(jié)構(gòu)大小、生理特征、代謝過程、免疫過程等 方面都與人類更接近。此外，豬發(fā)育周期短、繁殖率高、同窩產(chǎn)仔數(shù)多，在轉(zhuǎn)基因豬制備中， 具有較好的重復(fù)性。因此利用豬作為新的動(dòng)物模型能夠?yàn)槿祟愄峁└玫难芯抗ぞ摺?br>[0004] VASA基因是DEAD-box家族中的一員，它在生殖細(xì)胞增殖和分化過程中發(fā)揮著重 要作用。因?yàn)閂ASA基因僅能在許多生物的生殖系細(xì)胞中才會(huì)特異性表達(dá)，所以被廣泛地 當(dāng)作生殖細(xì)胞的分子標(biāo)記物來使用，并且VASA基因在動(dòng)物生殖細(xì)胞發(fā)生和生殖調(diào)控等方 面都起到了重要作用，并且還發(fā)現(xiàn)Vasa純合子突變的胚胎連生殖細(xì)胞前體細(xì)胞都無法發(fā) 育形成。VASA的基因編碼依賴于RNA解旋酶，而VASA還是DEAD - box家族中的一員。 DEAD-box家族蛋白參與和胞內(nèi)RNA對細(xì)胞調(diào)控的作用有關(guān)，它們也控制著RNA本身在細(xì)胞 內(nèi)的代謝。其中，調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄、pre-mRNA、核內(nèi)mRNA的剪切與運(yùn)輸；對調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯 起始與細(xì)胞器基因表達(dá)情況還有RNA降解等過程也有著重要調(diào)控作用。DEAD - box家族所 具有的RNA解旋酶活性是完成基因復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄等生命活動(dòng)所必需的，并且DEAD - box 家族廣泛存在于從真、原核細(xì)菌；酵母、植物到各種高等動(dòng)物，如哺乳動(dòng)物等的廣大真核生 物當(dāng)中。VASA基因在這些生物中保有較高的同源性。然而就魚類而言，VASA是目本前已 發(fā)現(xiàn)的極少數(shù)幾個(gè)在原始生殖細(xì)胞PGC中表達(dá)的分子標(biāo)簽之一，在生殖腺、生殖細(xì)胞的發(fā) 育過程中起著重要的作用。VASA在果蠅的胚胎發(fā)育中起著多重的功能。除了在極細(xì)胞(原 生殖細(xì)胞）的形成中起重要作用外，它還參與果蠅胚軸后極的決定。VASA的突變不但會(huì)導(dǎo) 致極細(xì)胞不能形成，還可導(dǎo)致胚胎腹部體節(jié)的產(chǎn)生異常發(fā)育。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是利用VASA基因的生殖特異性表達(dá)，來建立轉(zhuǎn)基因豬模型的利用 生殖特異性啟動(dòng)子表達(dá)ere的重組酶載體。
[0006] 本發(fā)明載體的構(gòu)建方法是： ① VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列擴(kuò)增與純化： 根據(jù)VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游4118 bp序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)分別在上下游引物5'-端引 入NheI與Seal酶切位點(diǎn)，以正常小型豬基因組為模板，利用Taq plus Mix擴(kuò)增VASA啟動(dòng) 子區(qū)片段； 引物序列如下所示： VASA-F :5，GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3， VASA-R :5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3， PCR 反應(yīng)體系包括 2 X Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2 各 0.5ul, Temple 0.1 yg ,H2O To 10 μ I ； ② VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列測序： 純化片段檢測后，利用T4 DNA連接酶連接到pGM-T載體，連接反應(yīng)體系包括： IOXLigase Buffer Iul;回收片段 6ul ;pGM_T Vector 0.5ul;T4 DNA ligase Iul ;H2O To 10 μ I ; ③ VASA-Cre表達(dá)載體構(gòu)建： 利用4300bp豬源VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列驅(qū)動(dòng)Cre重組酶表達(dá)的表達(dá)載體是通過 替換實(shí)驗(yàn)室保存的誘導(dǎo)性表達(dá)Cre重組酶載體pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neo中Mxl 序列完成的，構(gòu)建載體為 pET28a-VASA-Cre-BGHpolyA-FRT2neo,基因序列 SEQ ID NO :1， 命名為：VASA-Cre，載體全長：12, 088 bp。
[0007] 本發(fā)明VASA啟動(dòng)子區(qū)的組織特異性檢測：構(gòu)建了 VASA-TOM質(zhì)粒，將VASA的啟動(dòng) 子區(qū)與紅色熒光蛋白相連接，連接成功后，將VASA-TOM瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系，并檢測紅色 熒光表達(dá)情況。
[0008] 本發(fā)明利用生殖特異性啟動(dòng)子表達(dá)ere的重組酶載體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬的方法， VASA-cre質(zhì)粒經(jīng)過ApaLI限制性內(nèi)切酶酶切線性化，DNA片段回收，轉(zhuǎn)染豬胎兒呈成纖維 細(xì)胞中進(jìn)行陽性克隆篩選，將篩選出的陽性克隆細(xì)胞按常規(guī)進(jìn)行受精卵去核顯微注射和輸 卵管胚胎移植。
[0009] 本發(fā)明利用生殖特異性啟動(dòng)子表達(dá)ere的重組酶載體構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬的鑒定方法， 剪取出生后4天的豬耳組織，提取基因組作為PCR模板，Cre重組酶通用引物如下，擴(kuò)增目 的片段長944bp : 正向引物序列：GAATTCTCAATCGCCATCTTCCAGC 反向引物序列：AAGCTTATGGCCAATCTCCTGACCG PCR條件：預(yù)變性94°C 3分鐘；94°C變性30s ;55°C復(fù)性30s ; 72°C延伸30s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸5分鐘。
[0010] 本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)生殖系統(tǒng)特異表達(dá)Cre重組酶的質(zhì)粒，并且 重組質(zhì)?？梢栽谒幬飰毫ο陋?dú)立于細(xì)胞染色體外存在。該質(zhì)?？梢员ＷC在生殖系統(tǒng)中特異 表達(dá)ere重組酶，可以與Ioxp相結(jié)合，進(jìn)行相關(guān)生殖系統(tǒng)表達(dá)基因的敲除，為ere重組酶系 統(tǒng)的發(fā)展和相關(guān)基因的研究起到積極的推動(dòng)作用。
【附圖說明】
[0011] 圖1是VASA基因啟動(dòng)子區(qū)序列擴(kuò)增； 圖2是VASA-Cre重組質(zhì)粒圖； 圖3是VASA-Cre重組質(zhì)粒酶切鑒定； 圖4是VASA-tdTOMATO表達(dá)載體的構(gòu)建； 圖5是轉(zhuǎn)染后48 h各細(xì)胞熒光表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明載體的構(gòu)建方法是： VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列擴(kuò)增與VASA-Cre表達(dá)載體構(gòu)建 VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列擴(kuò)增與純化 根據(jù)VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游4118 bp序列設(shè)計(jì)引物，同時(shí)分別在上下游引物5'-端引 入NheI與Seal酶切位點(diǎn)，以正常小型豬基因組為模板，利用Taq plus Mix擴(kuò)增VASA啟動(dòng) 子區(qū)片段。引物序列如下所示： VASA-F :5，GGCTAGCCACAGATTTCAAGAGAGAAAGAAATGAGG 3， VASA-R :5' GAGTACTCCCGTTCTTCATTTGACCCAAAGTCCACC 3 PCR 反應(yīng)體系包括 2 X Taq plus Mix 5ul, Primer F2/R2 各 0.5ul, Temple 0.1 yg ,H2O To 10 μ 1。將各組分混合后，按如下條件設(shè)置PCR反應(yīng)程序：94°C : 5 min; 95°C : 30 s, 58°C : 30 s, 72°C : 3 min, 30 cycles; 72°C : 5 min。反應(yīng)完成后 4°C保存。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V，30 min)。DNA Marker III作分子量標(biāo)準(zhǔn)。初步 根據(jù)分子量大小鑒定PCR產(chǎn)物是否正確，并利用核酸純化試劑盒純化。純化好的DNA片段 測定濃度，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0013] 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列測序分析 純化片段檢測后，利用T4 DNA連接酶連接到pGM-T載體，連接反應(yīng)體系包括： IOXLigase Buffer Iul;回收片段 6ul ;pGM_T Vector 0.5ul;T4 DNA ligase Iul ;H20 To 10 μL。將各組分混勻后，16°C，連接過夜。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至ToplO大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞，具體操作如下：感受態(tài)細(xì)胞從_80°C冰箱取出后置于冰上，待解凍后加入10 μ 1重組質(zhì)粒，輕輕混勻。將轉(zhuǎn)化體系冰浴30 min，然后42°C熱激90 s (水浴鍋），繼續(xù)冰 浴2 min。向轉(zhuǎn)化體系中加入500 μ 1液體LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)40 min。取200 μ 1 轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞均勻涂布于預(yù)熱的含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)平板上，37°C溫箱培 養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的大腸桿菌在固體培養(yǎng)基上形成單菌落。挑取單菌 落，在含氨芐青霉素抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)后的液體LB培養(yǎng)基為 含單一質(zhì)粒的大腸桿菌菌液。利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，做進(jìn)一步鑒定。重組質(zhì)粒選 擇Seal位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定。將上述組分充分混合后，37°C水浴10 min。酶切完成后，取 5 μL酶切反應(yīng)體系利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（120 V，30 min)。DNA Marker III作分 子量標(biāo)準(zhǔn)。初步根據(jù)分子量大小鑒定重組質(zhì)粒是否正確。選擇正確的質(zhì)粒樣本測序鑒定。 測序結(jié)果利用NCBI Blast分析序列是否正確，并分析是否有突變位點(diǎn)。選擇正確的重組質(zhì) 粒（命名為pGMT-VASA)，-20°C保存，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0014] 表達(dá)載體構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)中，利用4118bp豬源VASA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列驅(qū)動(dòng)Cre重組酶表達(dá)的表 達(dá)載體是通過替換實(shí)驗(yàn)室保存的誘導(dǎo)性表達(dá)Cre重組酶載體pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neo中Mxl序列完成的。新構(gòu)建載體為pET28a-VASA-Cre-BGHpolyA-FRT2neo,命名為： VASA-Cre。載體全長：12,088 bp。
[0015] 首先，pET28a-Mxl-Cre-BGHpolyA-FRT2neo 表達(dá)載體與 pGM-T -VASA 重組質(zhì)粒利 用Nhel/Scal雙酶切，反應(yīng)體系如表1. 6所示：
將上述組分充分混合后，37°C水浴30 min。酶切完成后，將酶切反應(yīng)體系進(jìn)行1%瓊脂 糖凝膠電泳，并利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應(yīng)片段。利用T4 DNA連接酶將VASA啟動(dòng) 子區(qū)序列回收片段連接到回收的表達(dá)載體相應(yīng)位點(diǎn)。連接反應(yīng)體系如表包括=IOXLigase Buffer Iul ;VASA 回收片段 5ul ;表達(dá)載體片段 2ul ;T4 DNA Ligase Iul ;H20 To 10 μ1〇 將上述組分充分混合后，16°C，連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至ToplO大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并 均勻涂布于預(yù)熱的含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)平