一種克隆載體及其制備與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種克隆載體及其制備與應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] PCR技術(shù)的發(fā)明是分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域的重大突破。PCR技術(shù)誕生之后，將 PCR產(chǎn)物克隆入載體（通常為質(zhì)粒）的技術(shù)也獲得發(fā)展。目前已經(jīng)發(fā)展出多種構(gòu)建克隆的 方法，如限制性?xún)?nèi)切酶消化連接（restriction enzyme digestion and ligation)，不需連 接的克隆（ligation-independent cloning, LIC)，體內(nèi)連接（in vivo ligation)和位點(diǎn)特 異性重組系統(tǒng)（site-specific recombination systems)等。但是這些方法需要用到限制 性酶處理PCR產(chǎn)物和載體，或者需要特殊的菌株或某些特殊的酶，因而操作復(fù)雜且繁瑣，難 以進(jìn)行高通量操作。
[0003] 除了上述構(gòu)建克隆的方法之外，還有兩種常用且相對(duì)簡(jiǎn)單的克隆方法：TA克隆和 平末端連接。由Taq酶擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物含有dAMP尾巴，在T4連接酶的作用下，可以和含 有T末端的載體（T載體）連接，這就是TA克隆。而高保真DNA聚合酶通常含有3' -5'核 酸外切酶活性，它們擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為平末端，將這些片段與切成平末端的載體在T4連 接酶的作用下連接就是平末端連接。這兩種方法的共同特點(diǎn)是不需要事先用特殊的酶對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，而是直接連入載體，具有簡(jiǎn)單易操作的特性。雖然這兩種方法也存在缺 點(diǎn)（片段插入方向隨機(jī)，無(wú)法做到定向克?。?yàn)槠浜?jiǎn)單易操作的特性，因而在分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是比較適合進(jìn)行高通量操作。
[0004] 這兩種直接連接的克隆方法相比較，平末端連接比TA克隆更具優(yōu)勢(shì)。這是因?yàn)椋?一，Taq酶保真性差，用它來(lái)PCR擴(kuò)增片段，容易引入突變。一種折衷的方案是，用高保真DNA 聚合酶擴(kuò)增片段，然后給PCR產(chǎn)物加上dAMP尾巴，這需要增加一步反應(yīng)。二，TA克隆的效 率取決于T載體的質(zhì)量，目前僅有少數(shù)生物技術(shù)公司能夠提供高質(zhì)量的T載體且售價(jià)高昂， 一般實(shí)驗(yàn)室需要購(gòu)買(mǎi)T載體，這增加了實(shí)驗(yàn)成本。
[0005] 相比較之下，平末端連接方法采用高保真NA聚合酶擴(kuò)增片段，也不象T克隆那樣 需要高質(zhì)量的載體，因而簡(jiǎn)單也更經(jīng)濟(jì)。但因?yàn)檩d體被切成平末端，兩個(gè)平末端自身連接 (載體自連）就無(wú)法避免。在不采取措施的情況下，連接反應(yīng)得到的大多數(shù)是自連的載體， 而不是插入片段的載體，將插入片段的載體篩選出來(lái)就需要非常大的工作量。因此，載體自 連的問(wèn)題就成為平末端連接這種克隆方法的瓶頸。
[0006]目前，有兩種策略可用來(lái)克服載體自連帶來(lái)的困擾。一種策略是，使用堿性磷酸酶 對(duì)切成平端的載體進(jìn)行去磷酸化處理，使之無(wú)法自我連接，這種策略的缺點(diǎn)是增加了操作 的復(fù)雜性，另外也無(wú)法100%去磷酸化，仍不能避免空載體的產(chǎn)生。另一種策略是，利用一 定的篩選方案將空載體與有插入片段的載體分開(kāi)，從而提高平末端連接這種克隆方法的效 率。
[0007] 藍(lán)白斑篩選是最常用的將空載體和有插入片段的載體相分開(kāi)的一種篩選方案。在 這種方法中，報(bào)告基因 LacZa作為藍(lán)白斑篩選的標(biāo)記基因，但藍(lán)白斑篩選需要用到X-gal 和IPTG這樣一些昂貴且有毒性的化學(xué)物質(zhì)。也有報(bào)道采用熒光蛋白基因來(lái)作為報(bào)告基因， 但仍需要加 IPTG誘導(dǎo)熒光蛋白的表達(dá)。
[0008] CcdB是一個(gè)由ccdB基因編碼的小分子量蛋白質(zhì)，它能夠結(jié)合DNA促旋酶并使其失 活。在缺失DNA促旋酶的情況下，胞內(nèi)DNA無(wú)法復(fù)制，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因而CcdB是一種 細(xì)胞毒素蛋白。
[0009] 由于CcdB蛋白的毒性，克隆有ccdB基因的普通大腸桿菌菌株（如DH5 a，ToplO 等）無(wú)法生長(zhǎng)。國(guó)外公司篩選出一種大腸桿菌突變株，命名為大腸桿菌DB3.1，在這一菌株 中，編碼DNA促旋酶的基因發(fā)生了突變，使得DNA促旋酶的氨基酸序列發(fā)生改變，突變后的 DNA促旋酶不再與CcdB蛋白結(jié)合。因此在該菌株中，DNA正常復(fù)制，克隆體生長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種新的克隆載體及其應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明一方面提供了一種克隆載體pUC57-ccdB，為在pUC57載體的多克隆位點(diǎn)插 入有ccdB基因的改造載體，所述ccdB基因含有平末端限制性?xún)?nèi)切酶酶切識(shí)別位點(diǎn)。
[0012] 進(jìn)一步的，所述平末端限制性?xún)?nèi)切酶為Sma I。
[0013] ccdB基因在插入pUC57載體后需保證讀框正確。在載體中插入基因并保證讀框正 確是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉掌握的常規(guī)技術(shù)。
[0014] ccdB基因插入pUC57載體多克隆位點(diǎn)的具體位置并無(wú)特別限定。如本發(fā)明實(shí)施例 列舉的，ccdB基因插入pUC57載體多克隆位點(diǎn)的EcoR I和Hind III酶切識(shí)別位點(diǎn)之間。
[0015] 進(jìn)一步的，所述ccdB基因開(kāi)放閱讀框與pUC57載體Lac啟動(dòng)子方向一致。
[0016] 進(jìn)一步的，如實(shí)施例具體列舉的，所述ccdB基因的ORF(開(kāi)放閱讀框）序列為SEQ ID NO : 1〇
[0017] 本發(fā)明所述克隆載體pUC57-ccdB可在含F(xiàn)質(zhì)粒的宿主菌中擴(kuò)增。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述含有F質(zhì)粒的宿主菌為大腸桿菌ToplOF'。
[0019] 本發(fā)明第二方面還提供了所述克隆載體pUC57-ccdB的制備方法，為將ccdB基因 克隆入PUC57載體的多克隆位點(diǎn)獲得。
[0020] 本發(fā)明第三方面還提供了所述克隆載體pUC57-ccdB在基因工程領(lǐng)域的用途。
[0021] 本發(fā)明第四方面提供了一種基因克隆方法，為將目標(biāo)基因克隆入本發(fā)明的克隆載 體pUC57-ccdB的多克隆位點(diǎn)獲得克隆有目標(biāo)基因的載體，再將所述克隆有目標(biāo)基因的載 體導(dǎo)入不含F(xiàn)質(zhì)粒的宿主菌中增殖。
[0022] 可以將目標(biāo)基因與利用Sma I酶切的克隆載體pUC57-ccdB連接以獲得克隆有目 標(biāo)基因的載體。
[0023] 所述宿主菌優(yōu)選大腸桿菌。如實(shí)施例列舉的，不含F(xiàn)質(zhì)粒的宿主菌可選用E. coli DH5a 0
[0024] 本發(fā)明是以商品化質(zhì)粒pUC57為出發(fā)載體進(jìn)行改良后的載體。本發(fā)明利用CcdB 蛋白對(duì)不含F(xiàn)質(zhì)粒的大腸桿菌的致死作用，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)在pUC57質(zhì)粒上插入 ccdB (含Sma I酶切位點(diǎn)）基因，獲得載體pUC57-ccdB。通過(guò)平末端連接插入需要克隆的基 因，當(dāng)插入片段后可以破壞載體上ccdB基因，因而可以在不含F(xiàn)質(zhì)粒的大腸桿菌中增殖，從 而可以避免分子克隆中空載體的出現(xiàn)。隨著蛋白互作研究和轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析等的發(fā)展，在分 子生物學(xué)領(lǐng)域與基因工程領(lǐng)域迫切需要一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)的高通量克隆構(gòu)建方法和載體。本 發(fā)明有望在這方面發(fā)揮作用。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1是本發(fā)明中pUC57_ccdB載體的結(jié)構(gòu)示意圖
[0026] 圖2是pUC57-ccdB載體的構(gòu)建過(guò)程
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明利用ccdB基因來(lái)構(gòu)建平末端連接方法的克隆篩選方案，原理是在ccdB基 因中設(shè)計(jì)平末端酶切位點(diǎn)，只有當(dāng)PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)酶切位點(diǎn)，破壞CcdB蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)化菌 (不含F(xiàn)質(zhì)粒）才可以長(zhǎng)成菌落。而含有ccdB基因的質(zhì)粒的增殖則通過(guò)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌 株ToplOF'來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種方法相比較其它方法具有陽(yáng)性率高，不需另外不需要添加額外的 化學(xué)物質(zhì)，比如X-gal，IPTG等。
[0028] 含有F質(zhì)粒的大腸桿菌菌株如ToplOF'能夠抵抗CcdB蛋白的毒性，這可能是因?yàn)?F質(zhì)粒上同時(shí)含有ccdA基因的緣故。在自然界中，ccdA和ccdB -起構(gòu)成F質(zhì)粒的ccdAB 系統(tǒng)（control of cell division or death system)。ccdA 基因編碼另一種小分子量蛋 白質(zhì)CcdA，CcdA蛋白具有拮抗CcdB蛋白的作用，使之不能與DNA促旋酶結(jié)合。
[0029] pUC57是在大腸桿菌中常用的克隆載體，是一個(gè)小的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒，載體上有兩個(gè) 啟動(dòng)子，一個(gè)為AmpR promoter，啟動(dòng)氨節(jié)抗生素基因的表達(dá)，另一個(gè)為L(zhǎng)ac promoter，多克 隆位點(diǎn)位于Lac啟動(dòng)子的下游，當(dāng)克隆入基因 ccdB時(shí)，只有開(kāi)放閱讀框與啟動(dòng)子方向一致 時(shí)才能達(dá)到預(yù)期效果。否則ccdB基因只有很少一部分的表達(dá)，不會(huì)對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生致死作 用，只能抑制其生長(zhǎng)（長(zhǎng)出小的菌落）。
[0030] 實(shí)施例采用如下技術(shù)方案構(gòu)建pUC57-ccdB載體：
[0031] pUC57-ccdB載體的構(gòu)建：ccdB基因的ORF序列為SEQ ID NO :1，利用重疊延伸 PCR合成基因序列為SEQ ID NO :2。將重疊延伸PCR所得完整的ccdB基因以Nde I/Hind III酶切位點(diǎn)插入載體pET24a中，轉(zhuǎn)化E. coli ToplOF'感受態(tài)細(xì)胞，挑斑提取重組質(zhì)粒 pET24a-ccdB，測(cè)序鑒定；以測(cè)序正確的質(zhì)粒pET24a-ccdB為模板，以引物SEQ ID NO :11和 SEQ ID NO :12 PCR獲得的基因 ccdB插入載體pUC57中，抽提質(zhì)粒雙酶切鑒定。
[0032] 將鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒pUC57_ccdB轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明載體構(gòu) 建成功。
[0033] 重疊延伸PCR合成SEQ ID NO :2需要的引物分別為：ccdB-l(SEQ ID NO :3)、 ccdB-2(SEQ ID N0:4、c