一種使用漆酶催化合成水飛薊賓的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種使用漆酶催化合成水飛薊賓的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水飛薊素（Silymarin)是從菊科植物水飛薊（Silybum marianum Linn. Gaertn) 中提取出的一種黃酮類化合物，具有多種臨床功效，已被多國藥典收錄。水飛薊賓（Silybin 或Silibinin)是水飛薊素的4種異構(gòu)體中含量最高，活性最好的1種，由一分子黃杉素 (Taxifolin)和一分子松柏醇（Coniferyl alcohol)通過氧化偶合而成。
[0003]目前，人們獲取水飛薊賓的主要手段是從水飛薊種子中提取。然而，該提取工藝復(fù) 雜，成本較高；水飛薊的生長收到季節(jié)和環(huán)境的影響，且占用耕地；提取過程中使用有機溶 劑等，產(chǎn)品的安全性受到威脅。近年來，有人通過金屬離子（Ag 2O等）催化的方法，以松柏 醇和黃杉素為底物合成了水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體。然而，該合成過程依然是在有機溶 劑中進行的，且反應(yīng)時間較長（96h)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種使用漆酶催化合成水飛薊賓的方法，以漆 酶作為催化劑，以黃杉素、松柏醇作為底物，即可實現(xiàn)水飛薊賓的合成，是一種安全高效的 方法。
[0005] 所述的漆酶，為一種銅蛋白，屬于多酚氧化酶，以分子氧為電子受體來催化底物氧 化，能夠氧化多種有機和無機化合物。
[0006] 所述的漆酶來源于漆樹（Rhus vernicifera)，但不僅限于漆樹。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述漆酶濃度為0. 267U/mL。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述底物黃杉素、松柏醇的摩爾比為1 :1。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述底物黃杉素濃度為2. 775 X 10 5M。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述催化是在適合漆酶催化反應(yīng)的溫度、PH條件下 進行。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述催化是在pH 3. ο-pH 8. 0條件下進行。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，反應(yīng)體系的pH為6.0,通過添加 pH緩沖液控制pH。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述催化是在溫度25°C下進行。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述催化反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)為水溶液。
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述催化使用的反應(yīng)介質(zhì)是磷酸鹽緩沖液，以 NaH2P04/Na2HP0#lW液控制 pH。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，反應(yīng)介質(zhì)是0. 2M的pH6的磷酸鹽緩沖液。
[0017] 所述方法具體是：以pH 6. 0的磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，底物松柏醇、黃杉素的摩 爾比為1:1，酶的用量為0. 267U/mL，在25°C條件下反應(yīng)。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，松柏醇、黃杉素的摩爾濃度為2. 775X 10 5M,酶的終 濃度為0. 267U/mL，以pH6. O的0. 2M磷酸緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)。在25°C條件下反應(yīng)lh，水飛 薊賓的產(chǎn)量達到〇. 9694mg/L。反應(yīng)產(chǎn)物為水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體（水飛薊賓A、異水 飛薊賓A、水飛薊賓B和異水飛薊賓B)。
[0019] 本發(fā)明的有益之處：
[0020] 本發(fā)明提供了一種新的合成水飛薊賓的方法，用酶量低、pH和溫度范圍廣，不需要 額外添加其他物質(zhì)，反應(yīng)簡便易控，產(chǎn)物分離純化簡單，安全性高。本發(fā)明使用漆酶催化合 成水飛薊賓，可以在水相介質(zhì)、常溫條件下迅速反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)的金屬離子催化水飛薊賓 合成反應(yīng)所存在的反應(yīng)時間長（96h)和溫度高（75°C )導(dǎo)致的能耗高、效率低的缺陷，以及 必須使用有機溶劑導(dǎo)致的成本高、安全性不足等缺陷。使用本發(fā)明方法，在25°C條件下，Ih 之內(nèi)即可生成0. 9694mg/L水飛薊賓（4種水飛薊賓同分異構(gòu)體的總和，下同）。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :陰離子模式下水飛薊賓的質(zhì)譜圖；其中，481. 1140m/z為在陰離子模式下，水 飛薊賓脫氫的同位素峰之一；
[0022] 圖2 :Formula Predictor預(yù)測和實測的水飛薊賓同位素峰；其中，A為 C25H22O10[M-H] :predicted region for 481. 1140m/z ；B 為 measured region for 481.1140m/z ；
[0023] 圖3 :漆酶催化松柏醇和黃杉素合成水飛薊賓反應(yīng)體系的色譜圖；其中，8、9、10、 11分別為水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體；
[0024] 圖4 :漆酶催化水飛薊賓合成的反應(yīng)動力學(xué)曲線。
【具體實施方式】
[0025] 材料與方法
[0026] 松柏醇、黃杉素、水飛薊賓標準品和漆酶（Laccase, from Rhus vernicifera)購自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。松柏醇、黃杉素和水飛薊賓溶于甲醇（Sigma-Aldrich, HPLC grade)，配制成lg/L的標準品。
[0027] 0. 2M 磷酸鈉緩沖液（PBS, pH6. 0):將 0. 2M 的 Na2HPOjP 0. 2M 的 NaH 2P04按照 12. 3:87. 7(v/v)的比例混合。將緩沖液于冰上保存，使用前于25°C平衡。
[0028] 準確稱取一定質(zhì)量的松柏醇和黃杉素，分別以0. 2M PBS(pH6. 0)溶解并定容至 0. 555mM和0. 2774mM。以0. 2M PBS(pH6. 0)將漆酶溶解為5. 335U/mL。松柏醇和黃杉素溶 液于4°C避光保存，漆酶溶液于_20°C避光保存，使用前在冰上溶解。反應(yīng)在黑暗條件下、 25°C金屬浴中進行，反應(yīng)結(jié)束后立即加入一定體積的甲醇終止酶反應(yīng)，并置于冰上、避光， 直到進樣分析。
[0029] 產(chǎn)物水飛薊賓的鑒定使用SHIMADZU UPLC-MS-IT-T0F進行：
[0030] (1)流動相A :0.1 % (v/v)甲酸，流動相B :100%甲醇；洗脫梯度（以流動相B 的百分比表示）：〇min 30%、30.00min 55%、35.00min 55%、40min 30%;總流速 0.2mL/ min ;紫外檢測器，檢測波長288nm ;柱溫箱溫度40°C ;質(zhì)譜設(shè)置為陰離子模式，采集范圍 100-700m/z，離子富集時間10. 00msec，重復(fù)次數(shù)3,檢測器電壓：相對于調(diào)諧電壓。進樣體 積 10 μ L。
[0031] (2)分別準確配制2· 5、5· 0、10、20、40、80、100mg/L的水飛薊賓標準品。標準品的 分析方法與樣品的分析方法相同。以標準品的濃度作為縱坐標，以相應(yīng)提取離子流（m/z = 481. 1140)的峰面積作為橫坐標，繪制標準曲線。以陰離子模式下，樣品提取粒子流（m/z = 481. 1140)的峰面積，通過標準曲線方程計算樣品中水飛薊賓的濃度。
[0032] 實施例1
[0033] 為了驗證漆酶催化松柏醇和黃杉素合成水飛薊賓的能力，以松柏醇和黃杉素作為 底物，由漆酶（Laccase)催化水飛薊賓的合成。分別驗證了省卻底物或酶時，水飛薊賓的產(chǎn) 生情況，如表1所示。
[0034] 準確稱取一定質(zhì)量的松柏醇和黃杉素，分別以0. 2M PBS(pH6. 0)溶解并定容至 0. 555mM和0. 2774mM。以0. 2M PBS(pH6. 0)將漆酶溶解為5. 335U/mL。松柏醇和黃杉素溶 液于4°C避光保存，漆酶溶液于_20°C保存，使用前在冰上溶解。反應(yīng)在25°C避光條件下進 行，反應(yīng)時間為lh。反應(yīng)結(jié)束后立即加入100 μ L甲醇以終止酶反應(yīng)，并置于冰上、避光，直 到進樣分析。所有反應(yīng)均進行3次，取平均值。
[0035] 表1漆酶催化水飛薊賓合成的驗證
[0038] *MeOH在反應(yīng)結(jié)束后添加，用以終止酶促反應(yīng)。
[0039] 以2. 5、5. 0、10、20、40、80、100mg/L的水飛薊賓標準品繪制標準曲線，得到的標準 曲線的線性相關(guān)性R2= 0. 9993。以陰離子模式下，得到樣品提取粒子流（m/z = 481. 1140) 的峰面積，通過標準曲線方程計算樣品中水飛薊賓的濃度。結(jié)果表明，陰離子模式下，水飛 薊賓4種同分異構(gòu)體的核質(zhì)比均為481. 1140m/z，質(zhì)譜圖如圖1、圖2所示，色譜圖如圖3所 示。反應(yīng)2在陰離子模式下提取離子流（481. 1140m/z)有響應(yīng)，但信號極低，無法進行定量 分析。反應(yīng)3和反應(yīng)4中，提取粒子流（m/z = 481. 1140)沒有響應(yīng)。同時，反應(yīng)1中水飛 薊賓的產(chǎn)量為〇. 9694mg/L。
[0040] 以上結(jié)果表明，漆酶能夠催化松柏醇和黃杉素合成水飛薊賓，Ih內(nèi)產(chǎn)量可達到 0. 9694mg/L。松柏醇和黃杉素也可以自發(fā)地合成水飛薊賓，但自發(fā)反應(yīng)效率極低，以至于達 不到定量分析的下限。在缺少底物黃杉素或松柏醇的條件下，不能合成水飛薊賓。
[0041] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【主權(quán)項】
1. 一種使用漆酶催化合成水飛薊賓的方法，其特征在于，所述方法是以漆酶作為催化 劑，以黃杉素、松柏醇作為底物，催化合成水飛薊賓。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，催化是在適合漆酶催化反應(yīng)的溫度、pH條 件下進行。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述漆酶濃度為0. 267U/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物黃杉素、松柏醇的摩爾比為1 :1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化合成反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)為水溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化是在pH3.Ο-pH8. 0條件下進 行。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述催化使用的反應(yīng)介質(zhì)是磷酸鹽緩沖 液，以NaH2P04/Na2HP04緩沖對控制pH。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體是：以pH6. 0的磷酸緩沖 液為反應(yīng)介質(zhì)，底物松柏醇、黃杉素的摩爾比為1:1，酶的用量為0.267U/mL，在25 °C條件 下反應(yīng)。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一所述方法得到的水飛薊賓。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種使用漆酶催化合成水飛薊賓的方法，屬于生物化工領(lǐng)域。本發(fā)明以漆酶催化松柏醇和黃杉素合成了水飛薊賓的4種同分異構(gòu)體。該反應(yīng)在水相中進行，避免了有機溶劑的使用；反應(yīng)的效率較高，在1h內(nèi)即可生成0.9694mg/L水飛薊賓。該方法是一種安全且高效的合成水飛薊賓合成方法。
【IPC分類】C12P17/16
【公開號】CN105400843
【申請?zhí)枴緾N201510816624
【發(fā)明人】周景文, 陳堅, 呂永坤, 堵國成
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年11月20日