一種有效提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種有效提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn) 量的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 目前許多自主開發(fā)的新型農(nóng)用抗生素只是停留在實(shí)驗(yàn)室階段，其中關(guān)鍵的原因就 是生產(chǎn)菌的產(chǎn)素水平未達(dá)到工業(yè)化要求。所以，當(dāng)前擺在研究工作者面前一個(gè)主要的問題 就是提高現(xiàn)有和正在開發(fā)的農(nóng)用抗生素生產(chǎn)菌的產(chǎn)素水平，加快農(nóng)用抗生素的產(chǎn)業(yè)化進(jìn) 程。常規(guī)的微生物誘變育種費(fèi)時(shí)費(fèi)力、隨機(jī)性高，通過基因工程手段已可實(shí)現(xiàn)單基因編碼的 酶類的定向進(jìn)化并進(jìn)行超量表達(dá)，但對(duì)需要成簇基因編碼的抗生素等天然產(chǎn)物的產(chǎn)量提高 則困難重重。研究表明聯(lián)合抗藥性突變篩選方法是一種新穎的優(yōu)化抗生素產(chǎn)生菌的新方 法，聯(lián)合抗藥性突變可加強(qiáng)微生物合成抗生素的水平，并且這一優(yōu)化菌株的新方法能夠應(yīng) 用于多種抗生素生產(chǎn)菌株的優(yōu)化并且能夠提高野生型菌株的抗生素產(chǎn)量。
[0004] 四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可抑制多種植物病原真菌的生長，在生物防治上具有廣闊 的應(yīng)用前景。淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（StrejOtopees i/iasia可合成3種四稀 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素：四霉素 P、四烯菌素 B和四霉素 A，利用聯(lián)合抗藥性突變篩選方法改良淀 粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D使其提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素合成能力的研究未見有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明通過聯(lián)合抗藥性突變株的篩選，獲得對(duì)利福平、低濃度鏈霉素和高濃度鏈 霉素都產(chǎn)生抗藥性的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的突變株，獲得的突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗 生素的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高。該發(fā)明為提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的產(chǎn)量 提供了一種可靠的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)野生型菌株淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 水平低的不足，提供一種提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)素水平的方法；本發(fā)明的另一目的 是提供了一株高產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D突變株。
[0007] 本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)： 一種有效提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)量的方法按以下步驟進(jìn)行： (1)利福平抗性突變株的獲得(第一輪抗藥性突變株篩選） 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（SirejOi/iasia ，定名為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 D。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號(hào)CGMCC No. 2060。
[0008] 制備利福平終濃度為20 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中利福平濃 度為20 μ g/mL。GYM固體培養(yǎng)基組分與濃度為葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4 g/L，Dried Malt extract-S 10 g/L，N-Z-Amine A I g/L，NaCl 2 g/L，OB 溶液 600 yL， 定容后用2 mol/L NaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7. 3,瓊脂20 g/L ;其中OB溶液配置方法：稱取 MgS04 · 7H20 25g，CuSO4 · 5H20 2. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 3. 75g，MnSO4 · 5H20 I. 8g，CaCl2 · 2H20 17. 5g，ZnSO4 · 7H20 4. 5g，加500 mL水，用前搖勻；用移液槍吸取100 μ L淀粉酶產(chǎn)色鏈霉 菌D孢子懸液（I X IO6個(gè)/mL)于含有20 μ g/mL利福平的GYM固體平板上，用無菌涂布棒 涂布均勾，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，分別挑取單菌落至新的含有20 μ g/mL利福平的GYM 固體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，能再次在該新的GYM固體平 板上長出的菌株即為利福平抗性突變株。
[0009] (2)低濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第二輪抗藥性突變株篩選） 制備鏈霉素終濃度為30 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為 30 μ g/mL。GYM固體培養(yǎng)基組分與濃度同步驟（1);用移液槍吸取100 μ L利福平抗性突 變株(也即第一輪抗藥性篩選獲得的突變株)孢子懸液（I X IO6個(gè)/mL)于含有30 μ g/mL鏈 霉素的GYM固體平板上，用無菌涂布棒涂布均勻，置28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，分別挑取單菌 落至新的含有30 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28 °C培養(yǎng)箱 培養(yǎng)5天，能再次在該新的GYM固體平板上長出的菌株即為低濃度鏈霉素抗性突變株。
[0010] (3)高濃度鏈霉素抗性突變株的獲得(第三輪抗藥性突變株篩選） 制備鏈霉素終濃度為300 μ g/mL的GYM固體平板，也即GYM固體平板中鏈霉素濃度為 300 μ g/mL。GYM固體培養(yǎng)基組分與濃度同步驟（1);用移液槍吸取1000 μ L第二輪篩選 獲得的突變株孢子懸液（I X 1〇12個(gè)/mL)于含有300 μ g/mL鏈霉素的GYM固體平板上，用 無菌涂布棒涂布均勻，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)10~15天，分別挑取單菌落至新的含有300 μ g/ mL鏈霉素的GYM固體平板(一個(gè)單菌落劃一個(gè)平板)，置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10天，能再次在 該新的GYM固體平板上長出的菌株即為高濃度鏈霉素抗性突變株。
[0011] (4)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株液體發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)液為GYM液體培養(yǎng)基，組分與濃度為葡萄糖4 g/L，Dried yeast extract 4 g/L，Dried Malt extract-S 10 g/L, N-Z-Amine A I g/L，NaCl 2 g/L, OB 溶液600 μ L，定容后用2mol/L NaCl溶液調(diào)節(jié)pH至7. 3 ;其中OB溶液配置方法：稱取 MgS04 · 7H20 25g，CuSO4 · 5H20 2. 5g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 3. 75g，MnSO4 · 5H20 I. 8g，CaCl2 · 2H20 17. 5g，ZnSO4 · 7H20 4. 5g，加500 mL水，用前搖勻；每300 mL三角瓶裝60 mL發(fā)酵培養(yǎng)液， 配制后121°C滅菌20 min，待冷卻至50 °C，無菌條件下分別挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產(chǎn)色鏈霉 菌D和突變株孢子接種，28°C ± 1°C，發(fā)酵培養(yǎng)6天；發(fā)酵液經(jīng)5000 r/min離心10 min，上 清液用于四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素含量的測(cè)定； (5)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測(cè) 方法：采用SHIMADZU C18色譜柱（150 mmX4.6 mm，5 μπι)，甲醇為流動(dòng)相A，水為流 動(dòng)相 Β，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?0-30 min，65%-80% A;30-50 min，80%-100% A;50-60 min， 100%-65% Α;流速 LO mL/min，檢測(cè)波長 305 nm，柱溫 30 °C。
[0012] 本發(fā)明的有益效果： 一是本發(fā)明通過聯(lián)合抗藥性突變株的篩選，獲得的突變株合成四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 的能力比淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯著提高，這為提高四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的產(chǎn)量提供了一 種可靠的方法； 二是本發(fā)明提供了一株高產(chǎn)四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌突變株，為今 后四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)