檢測STMN1 mRNA表達量的引物、Taqman探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測STMNl mRNA表達量的引物、Taqman 探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 微管不穩(wěn)定蛋白（STMNl)是一種高度保守的細胞內(nèi)可溶性磷酸蛋白質(zhì)，在細胞周 期的不同階段通過磷酸化和去磷酸化作用來調(diào)節(jié)細胞微管系統(tǒng)的動力學平衡，控制細胞周 期，改變細胞的增殖、分化等生物學行為。其對于微管的調(diào)節(jié)作用是有絲分裂中紡錘體形成 的重要保障，因而也成為了抗微管類藥物的直接靶點。
[0003] 抗微管類藥物是通過作用于細胞微管而影響紡錘體形成，并抑制細胞有絲分裂的 一類廣譜化療藥。臨床上被廣泛應(yīng)用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、食 管癌等。目前常用的抗微管類藥物主要為紫杉烷類和長春堿類，紫杉烷類包括紫杉醇、多西 他賽，主要通過促進腫瘤細胞內(nèi)的微管聚合以及穩(wěn)定已聚合的微管，導致細胞內(nèi)大量微管 聚集，進而干擾細胞各種功能，特別是使細胞停止分裂；長春堿類包括長春堿，長春新堿和 長春瑞濱等，它們可以抑制腫瘤細胞內(nèi)微管蛋白的聚合、抑制紡錘體微管的形成，使核分裂 停滯于細胞分裂中期，從而抑制腫瘤細胞生長。STMNl通過促進微管的解聚或阻止微管的聚 合從而影響有絲分裂紡錘體的形成，影響細胞的正常分裂。STMNl蛋白的表達情況直接影響 到抗微管藥物的化療活性，因而對于STMNl的檢測有利于臨床醫(yī)生對于病人的個體化用藥 選擇。
[0004] 從檢測角度上來說，對于mRNA表達水平的檢測主要有Nothern blot雜交、原位雜 交、RT-PCR以及近幾年興起的液相芯片法。Nothern blot和原位雜交由于操作復雜，對于 操作人員的技術(shù)要求較高，檢測時間長等原因?qū)е缕鋺?yīng)用受到限制；液相芯片法檢測靈敏 度高，可同時檢測多個指標，但是由于液相芯片法成本高，對于檢測設(shè)備要求也高，因而推 廣受到限制；而RT-PCR由于操作相對簡單，檢測時間短，檢測設(shè)備在大多數(shù)醫(yī)院都可以得 到滿足，因而在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。
[0005] RT-PCR主要包括半定量PCR和定量PCR兩種，而定量PCR又包含相對定量PCR和 絕對定量PCR。絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數(shù)；相對定量方法則是比較經(jīng) 過處理的樣品和未經(jīng)處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表達差異。所謂相對定量是指在測定 目的基因的同時測定某一內(nèi)源性基因，該基因的作用有：（1)用于核苷酸的拷貝數(shù)的比較； ⑵作為內(nèi)源性對照補償待測樣本的體積變異、核酸抽提過程中造成的目的基因變異，以及 反映反應(yīng)體系內(nèi)是否存在PCR擴增的影響因素；（3)標準化標本。由于基因在各種組織中 是恒定表達的，所以可以以基因的定量來作為某種標準以比較樣本來源不同的目的基因表 達量的差異。通常選用的基因有GAPDH、f3-ACTIN、B2M和rRNA，研究者也可以根據(jù)具體的 需要而選定合適的基因。
[0006] 常用的相對定量可分為雙標準曲線法和△ AC t法。相對定量較為早期使用的方 法是用一系列已知外參物做標準曲線，根據(jù)該標準曲線得到目的基因和基因的量，再將目 的基因的同基因的比值作為定量的最后結(jié)果。這一方法要求外參、目的基因和基因的擴增 效率一致。這種方法通量較低，但結(jié)果會更加準確。另一種是用AAC t方法進行相對定 量。△ AC t方法使用單一的樣品（被稱為校正樣品）來比較未知樣品的目標基因的表達。 校正樣品在每個板上與未知樣品同時分析。校正公式為：這里Δ AC t = [C (目的 基因）-C t待測樣本（基因）]-[C t校正樣本（目的基因）-C t校正樣本（基因）]。校正樣品是任何 被選做代表1倍目的基因表達量的樣品。這一公式基于這樣一種假設(shè)：目的基因的擴增效 率與看家基因的擴增效率相同，效率接近于1，并且目標基因擴增一倍其Ct值減少一個循 環(huán)。實際情況很少會與這一假設(shè)完全相符，然而，這種方法的優(yōu)越性在于，由于無需在每個 板上對靶基因進行標準曲線分析使樣品的通量得以增加，并且這一方法更有益于檢測基因 表達的誘導或下調(diào)。
[0007] 在臨床上被廣泛應(yīng)用的是相對定量PCR，它可以準確檢測出一個基因的相對表達 變化，從而為患者病情的診斷提供參考依據(jù)。相對定量PCR有兩種檢測方法，一種是SYBR green染料檢測法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻 入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而 保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步；另一種是Taqman探針法，當探針完整時， 報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶活性將探 針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號， 即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完 全同步。SYBR green法操作簡單，價格也比較便宜，靈敏度也相對較高，因而受到青睞，科學 研究中很多使用SYBR green法，但是由于SYBR green染料結(jié)合的是雙鏈DNA，不具有特異 性，因此也比較容易出現(xiàn)假陽性的情況；Taqman法具有靈敏度高，特異性好的特點，因而在 臨床上普遍采用這種方法，但是由于探針結(jié)合所需要的溫度較高，因此探針的片段長度一 般也比較長，不利于找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)，此外，探針長度的增加也降低 了探針結(jié)合的效率，影響了檢測結(jié)果的準確性。此外，常規(guī)Taqman探針法無法識別cDNA和 基因組的差別，無法避免在RNA提取過程中摻雜的基因組而導致產(chǎn)生假陽性的情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)檢測能力的不足，本發(fā)明在Taqman探針法的基礎(chǔ)上提供一種 具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度檢測STMNl mRNA表達量的引物和Taqman探 針。
[0009] 基于以上引物和探針，本發(fā)明還提供了一種操作方法簡單的檢測STMNl mRNA表達 量的試劑盒，尤其適用于檢測患者腫瘤細胞中的STMNl mRNA表達量。
[0010] 本發(fā)明提供的檢測STMNl mRNA表達量的引物和Taqman探針，所述引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO: 1~2所示，所述Taqman探針的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；探針 5'端標記熒光報告基團，3'端標記淬滅基團。
[0011] 優(yōu)選地，Taqman探針為Taqman MGB探針。
[0012] 本發(fā)明引物設(shè)計的原理是在STMNl基因的2、3號外顯子上設(shè)計跨外顯子的上、下 游特異性引物。上游引物的5'端和3'端分別設(shè)計在2號外顯子和3號外顯子上，并且上 下游引物之間隔了一個長達1000多bp的內(nèi)含子，以及高特異性的MGB探針，故只能識別經(jīng) 過剪切修飾的成熟的STMNl mRNA，而無法識別基因組中STMNl的序列，避免了在組織RNA提 取過程中混入少量基因組DNA而導致實驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性的情況。
[0013] 另外，本發(fā)明優(yōu)選采用Taqman-MGB探針，與普通的Taqman探針比較，MGB探針具 有兩大特點：一是探針3'端標記了自身不發(fā)光的淬滅分子，以取代常規(guī)可發(fā)光的TAMRA等 熒光標記。這使熒光本底信號的干擾大大降低，熒光光譜分辨率得以大大改善。二是探針 3'端增加了一個MGB。MGB可以穩(wěn)定探針與模板的雜交，提高探針的退火溫度，一方面縮短 了探針長度，使熒光基團和淬滅基團的距離更近，淬滅效果更好；另一方面，也提高了探針 的特異性，使結(jié)果更精確，分辨率更高。
[0014] 本發(fā)明提供的檢測STMNl mRNA表達量的試劑盒，包括以上所述的檢測STMNl mRNA 表達量的引物和Taqman探針。
[0015] 優(yōu)選地，試劑盒中還包括內(nèi)參基因 B2M的擴增引物和Taqman-MGB探針，B2M的擴 增引物核苷酸序列如SEQ ID N0:4~5所示，B2M的Taqman-MGB探針核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。所述內(nèi)參基因探針同樣為Taqman-MGB探針，探針的5'端標記有熒光報告基團， 3'端標記有非熒光性淬滅基團。
[0016] 在進行熒光定量PCR的時候，還需要使用適當?shù)膬?nèi)參引物及相應(yīng)的熒光探針以便 進行定量。實驗數(shù)據(jù)表明B2M較GAPDH和β -ACTIN是更加穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
[0017] 優(yōu)選地，試劑盒中還包括陰性對照品、STMNl標準品和Β2Μ標準品；其中，陰性 對照品為超純水，STMNl標準品為含有SEQ ID NO :7所示核苷酸序列（GeneBank編號為 NM_001145454. 1的第81位至第321位堿基）的重組pUC57質(zhì)粒載體，B2M標準品為含有 SEQ ID NO :8所示核苷酸序列（GeneBank編號為NM_004048. 2的第300位至550位堿基） 的重組PUC57質(zhì)粒載體。
[0018] pUC57載體可直接購買市售商品，重組pUC57載體按照現(xiàn)有已知構(gòu)建重組載體的 技術(shù)進行即可。
[0019] 優(yōu)選地，試劑盒中還包括TaqMan? Fast Advanced Master Mix, PCR緩沖液和 dNTPs。TaqMan? FastAdvanced Master Mix為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。
[0020] 優(yōu)選地，試劑盒中試劑分裝為以下四組：
[0021] STMNl 8 聯(lián) PCR 反應(yīng)條：每一聯(lián)的管中含有TaqMan? Fast Advanced Master Mix，檢測STMNlmRNA表達量的引物和Taqman探針，10XPCR緩沖液，dNTPs，礦物油和超純 水；
[0022] B2M 8 聯(lián)PCR反應(yīng)條：每一聯(lián)的管中含有 TaqMan? Fast Advanced Master Mix， B2M的擴增引物和Taqman-MGB探針，10XPCR緩沖液，dNTPs，礦物油和超純水；
[0023] STMNl標準品：梯度濃度的STM