薏苡黑穗病菌檢測(cè)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及一種準(zhǔn)確且操作簡單的薏苡黑穗病檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]薏苡在我國各地均有種植，是傳統(tǒng)的藥食兼用作物。黑穗病是薏苡生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的病害之一，感病地區(qū)的產(chǎn)量損失為30-50%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)到80-100%。該病由薏苡黑粉病菌引起，為苗期侵染的系統(tǒng)性病害，帶菌種子和土壤中越冬的冬孢子是薏苡黑穗病的初侵染源，破壞植株穗部花器，使其最終變?yōu)榘谏裨咦拥暮谒搿?br>[0003]薏苡黑穗病是一種真菌型病害，傳統(tǒng)檢測(cè)植物病原真菌的方法主要包括形態(tài)觀察、癥狀診斷和生物學(xué)特性檢測(cè)，并結(jié)合柯赫氏法進(jìn)行鑒定，該方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)于發(fā)病癥狀相似的病害難以做出準(zhǔn)確的判斷。近代發(fā)展起來的植物真菌病害分子檢測(cè)技術(shù)包括4種，分別為DNA探針技術(shù)、基于PCR的DNA檢測(cè)技術(shù)、DNA指紋技術(shù)和DNA芯片技術(shù)，其中基于PCR技術(shù)的病原分子診斷方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確且在一般的分子生物實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行病菌檢測(cè)，有利于育種家們?cè)诓『Υ竺娣e發(fā)生前做好防治工作，已經(jīng)在多種作物中廣泛建立。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)果準(zhǔn)確且操作簡單的薏苡黑穗病檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明是一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的薏苡黑穗病檢測(cè)方法，包括薏苡黑穗病病原菌分離、病原菌基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)等步驟，下面進(jìn)行詳細(xì)說明:
(1)薏苡黑穗病病原菌分離:從薏苡植株上剪除含有薏苡黑穗病菌的花苞并對(duì)其外表面進(jìn)行消毒后置于超凈工作臺(tái)上，用無菌小刀劃破花苞，出現(xiàn)黑色粉末，即黑穗病病菌孢子，將花苞中的黑穗病病菌抖落到滅過菌的報(bào)紙上，然后用無菌解剖針取少許黑穗病病菌孢子，置于無菌水中進(jìn)行稀釋，再接種于馬丁氏培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基上長出密生的白色菌絲。挑取單孢菌落接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基(含30mg/L鏈霉素)中，28°C，220rpm搖菌，暗培養(yǎng)36h。
[0006](2)病原菌基因組DNA提取:對(duì)馬鈴薯培養(yǎng)基中的大量菌絲進(jìn)行離心收集，轉(zhuǎn)入研缽中，加入石英砂、PVP和液氮，迅速研磨破碎細(xì)胞；然后快速轉(zhuǎn)入到2mL離心管中，加入 65°C預(yù)熱的 DNA 提取液(2% CTAB, 100 mmol/L Tris-HCl, 1.4mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，濃度2% PVP，濃度1% SDS，pH為8.0，提取液使用前加入β-巰基乙醇至終濃度為2%) 0.8mL，渦旋混勻，65°C水浴30min，其間上下顛倒3_5次；冷至室溫后，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)抽提，上下顛倒混勻后，4°C離心lOmin，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm ;小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液進(jìn)行第二次抽提，4°C離心lOmin，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm ;小心吸取上清，加入2倍體積預(yù)冷的乙醇，至于_80°C冰箱中助沉30min ;恢復(fù)至室溫后，4°C離心lOmin，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm ;去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，每次洗滌后4°C離心8min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm ;用無水乙醇洗滌沉淀一次，4°C離心8min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm ;在超凈工作臺(tái)上吹干沉淀，加入30 μ L滅菌水，取3 μ L進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，保存于-20°C冰箱中備用。
[0007](3)薏苡黑穗病病原菌分子檢測(cè):以黑粉菌屬配型基因特異性引物bE4/bE8為本檢測(cè)體系所用引物，
bE4:5 ’ CGCTCTGGTTCATCAACG3’，bE8:5 ’ TGCTGTCGATGGAAGGTGT3’。
[0008]反應(yīng)體系總體積為25 yL:薏苡黑穗病病原菌DNA 1.0 μ L, dNTP(2.5mM) 2.0yL，bE4(10 μ Μ) 1.0 yL，bE8(10 μ Μ) 1.0 yL，10X Buffer (Mg2+ plus) 2.5 μ L，ddH20 17.3 μ LTaq 酶(3U/μ L) 0.2 yL。
[0009]反應(yīng)條件為:94°C 3 min ；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 10 min。PCR產(chǎn)物跑1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得片段大小為459bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是用利用分子生物學(xué)技術(shù)建立了基于PCR技術(shù)的薏苡黑穗病檢測(cè)方法，代替了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察和指示植物法，使病原菌的檢測(cè)快速、準(zhǔn)確且易于操作。同時(shí)，本方法獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，還可以通過測(cè)序?qū)Σ煌瑏碓吹牟≡M(jìn)行分類學(xué)或遺傳多樣性的研究。
【附圖說明】
[0011]圖1為薏苡黑穗病菌PCR檢測(cè)瓊脂糖電泳圖，圖中，l:marker DL2000; 2:陽性對(duì)照，3 μ L ;3:從感病黔薏1號(hào)分離的黑穗病病原菌PCR結(jié)果，5 μ L; 4:從感病興仁小白殼分離的黑穗病病原菌PCR結(jié)果，5yL。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0013]實(shí)施例1:
如圖1所示，以黔薏1號(hào)和興仁小白殼分別為原料，按如下步驟實(shí)施:
(1)從薏苡植株上剪除因感染薏苡黑穗病菌而膨大的花苞，對(duì)其外表面進(jìn)行消毒后置于超凈工作臺(tái)上，用無菌小刀將其劃破，將花苞中的黑穗病病菌抖落到滅過菌的報(bào)紙上，用無菌解剖針取少許黑穗病病菌孢子，置于無菌水中進(jìn)行稀釋，再接種于馬丁氏培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基上長出密生的白色菌絲。
[0014](2)挑取培養(yǎng)基上單孢菌落接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基(含30 mg/L鏈霉素)中，28°C，220 rpm搖菌，暗培養(yǎng)36 h。
[0015](3)對(duì)馬鈴薯培養(yǎng)基中的大量菌絲進(jìn)行離心收集，轉(zhuǎn)入研缽中，加入石英砂、PVP和液氮，迅速研磨破碎細(xì)胞；然后快速轉(zhuǎn)入到2 mL離心管中，加入65 °C預(yù)熱的DNA提取液0.8mL，渦旋混勻，65 °C水浴30 min，其間上下顛倒3_5次。
[0016](4)冷至室溫后，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)抽提，上下顛倒混勻后，4 V離心10 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。
[0017](5)小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的2 mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)混合液進(jìn)行第二次抽提，4°C離心10 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。
[0018](6)小心吸取上清，加入2倍體積預(yù)冷的乙醇，至于_80°C冰箱中30 min ;恢復(fù)至室溫后，4°C離心lOmin，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。(7)去除上清，沉淀用70 %乙醇洗滌兩次，每次洗滌后4 °C離心8 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm。
[0019](8)用無水乙醇洗滌沉淀一次，4 °C離心8 min，離心轉(zhuǎn)速為12000 rpm ;在超凈工作臺(tái)上吹干沉淀，加入30 μ L滅菌水，取3 μ L進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，保存于-20°C冰箱中備用。
[0020](9) PCR反應(yīng)體系總體積為25 μ L:薏苡黑穗病病原菌DNA 1.0 μ L，dNTP (2.5mM)
2.0 yL, bE4(10 μΜ) 1.0 μ L，bE8 (10 μ Μ) 1.0 μ L，10 X Buffer (Mg2+ plus) 2.5 μ L，ddH2017.3 yL Taq 酶(3U/yL) 0.2 μ L。反應(yīng)條件為:94 °C 3 min ；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72°C 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。PCR產(chǎn)物跑1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得片段大小為459bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021]當(dāng)然，以上只是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例，本發(fā)明還有其他的實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明所要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種薏苡黑穗病菌檢測(cè)的方法，其特征在于:在有薏苡黑穗病病癥的薏苡植株上分離薏苡黑穗病病原菌，對(duì)含有薏苡黑穗病病原菌的花苞表面進(jìn)行消毒，用馬丁氏培養(yǎng)基篩選獲得單孢菌落，然后用馬鈴薯液體培養(yǎng)基將單孢菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得大量的病原菌；利用CTAB法提取薏苡黑穗病病原菌基因組DNA，用黑粉菌屬配型基因特異性引物bE4/bE8對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，若能擴(kuò)增出一條長459bp黑穗病菌特異保守序列的目的片段，則證明所分離的病菌為薏苡黑穗病病原菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薏苡黑穗病病原菌檢測(cè)方法，其特征在于:實(shí)驗(yàn)材料是從田間采集含有感染黑穗病病原菌的未破裂花苞的薏苡植株頂端部分，將整個(gè)花苞從蒂部剪掉后即得。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薏苡黑穗病病原菌檢測(cè)方法，其特征在于:所述馬丁氏培養(yǎng)基篩選是將完整的花苞外表面進(jìn)行75%乙醇消毒，放置于超凈工作臺(tái)中的無菌報(bào)紙上，用無菌刀片劃開花苞，將花苞中的黑穗病病菌抖落到滅過菌的報(bào)紙上，然后用無菌解剖針取少許黑穗病病菌孢子，置于無菌水中進(jìn)行稀釋，分散接種在幾個(gè)馬丁氏培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)48h，獲得薏苡黑穗病的單孢菌落。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薏苡黑穗病菌檢測(cè)方法，其特征在于:將馬丁氏培養(yǎng)基上長出的白色菌絲作為薏苡黑穗病病原菌，然后將其接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基中進(jìn)行大量繁殖。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的薏苡黑穗病病原菌檢測(cè)方法，其特征在于:所述黑粉菌屬bE交配型基因特異性引物bE4/bE8的序列分別為:bE4:5 ’ -CGCTCTGGTTCATCAACG-3’bE8:5 ’ -TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3’。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種薏苡黑穗病檢測(cè)的方法，它主要是從感病薏苡花苞中分離獲得薏苡黑穗病病菌，然后對(duì)黑穗病菌提取DNA，利用黑粉菌屬<i>bE</i>交配型基因特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物有無和片段大小來確定病原菌是否為薏苡黑穗病。該方法較傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，而且獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物還可進(jìn)行其他分子生物學(xué)研究。
【IPC分類】C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號(hào)】CN105400890
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510968582
【發(fā)明人】楊成龍, 付瑜華, 羅凱, 王建, 蒙秋伊, 劉鵬飛, 周明強(qiáng), 劉凡值, 李志芳, 黎青, 班秀文, 敖茂宏, 周祥
【申請(qǐng)人】貴州省亞熱帶作物研究所
【公開日】2016年3月16日
【申請(qǐng)日】2015年12月22日