用于檢測hbv核酸的引物組、探針、試劑盒及檢測樣本中hbv核酸的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及乙型肝炎病毒（HBV)核酸的檢測。更具體地，本發(fā)明涉及針對HBV基 因序列的特異性引物、引物組和/或探針，包含HBV特異性引物組和/或探針的用于HBV檢 測的組合物，包含所述組合物的HBV檢測試劑盒，以及用于檢測HBV核酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒（HBV)感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，我國屬于乙型肝炎感染地 方性流行區(qū)。長期HBV感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和原發(fā)性肝癌的主要原因。因 此，對慢性乙型肝炎進行積極的治療或干預具有重要的意義。乙肝病毒復制是慢性乙型肝 炎活動的根本原因。因此，定期對乙肝患者體內(nèi)的HBV核酸進行準確地定量檢測對確定慢 性乙型肝炎的治療時機和治療方案顯得尤為重要。
[0003] HBV核酸的定量檢測除用于慢性乙肝的監(jiān)測外，感染者外周血中HBV的病毒載量 也是決定是否需要抗病毒治療的重要指標，用藥后病毒載量的變化也是判斷抗病毒治療效 果的重要依據(jù)，對判斷療效、預后和耐藥發(fā)生至關(guān)重要，是對治療方案進行優(yōu)化和調(diào)整的重 要依據(jù)。因此，高敏感的HBV核酸定量檢測方法具有重要的臨床意義。
[0004] 目前國內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院普遍采用國產(chǎn)的熒光定量PCR試劑來監(jiān)測患者外周血中的 HBV病毒載量，其價格較便宜，但普遍靈敏度不高，重復性較差，對于較低水平的病毒載量 (低于30IU/ml)往往不能準確地檢出。目前在國內(nèi)應用的進口試劑主要有羅氏的COBAS amplicor及COBAS Taqman，其中COBAS Taqman HBV DNA檢測是美國批準的唯--種采用 Taqman技術(shù)的自動控制技術(shù)，是慢性乙型肝炎臨床實踐指南中推薦的HBV DNA檢測方法。 該方法具有靈敏度高、線性范圍寬、重復性好等優(yōu)點，檢測范圍可達20IU/ml~1.7X IO8IU/ ml，但其設備昂貴，檢測費用高，目前還難以在臨床廣泛應用，特別是欠發(fā)達地區(qū)。另外，治 療后的HBV DNA水平可能低于羅氏COBAS Taqman的檢測下限而被漏檢。因此，目前亟需一 種更加高靈敏和高特異的HBV核酸的檢測方法，以指導慢性乙型肝炎的臨床治療。
[0005] 此外，目前市場上的HBV DNA檢測試劑一般針對HBV基因中遺傳變異較小的基因 區(qū)進行檢測，如S區(qū)，C區(qū)，X區(qū)等。雖然這些區(qū)域較為保守，但也具有低概率的變異，如突 變，且不同亞型之間的序列也存在多態(tài)性。如果在引物探針結(jié)合的堿基序列中發(fā)生變異或 存在多態(tài)性，就有可能導致PCR擴增失敗而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，影響對HBV感染的診斷及慢性 乙型肝炎的治療。目前已有針對HBV兩個基因區(qū)同時進行檢測的報道，但仍存在檢測靈敏 度低（20IU/ml)、定量限低（40IU/ml)等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目標在于提供能滿足上述要求的用于高靈敏檢測 HBV核酸的引物組、探針以及包含所述引物組和探針的試劑盒。本發(fā)明的引物組和探針可以 同時檢測HBV基因的兩個保守區(qū)域，因此可解決因 HBV其中一個基因序列突變而產(chǎn)生漏檢 的問題。此外，為了解決由于不同基因型之間擴增效率差異而敏感度不同的問題，本發(fā)明在 引物和探針的變異位置引入了核苷類似物I堿基，保證不同基因型都具有較高的敏感性。
[0007] 本發(fā)明為了解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測HBV核酸的引物組，所述引物組包括至少 一種選自以下的引物組：
[0009] (1)引物組1，其包含具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列的引物；和
[0010] ⑵引物組2,其包含具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO. 4 所示的核苷酸序列的引物。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種用于檢測HBV核酸的探針，所述探針包括至少一 種選自以下的探針，或者包括至少一種以下序列的反向互補序列：
[0012] (1)探針1，其具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；和
[0013] (2)探針2,其具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；
[0014] 以上所述探針通過標記物來標記。
[0015] 其中用于檢測HBV核酸的探針的一個末端標記熒光基團，且用于檢測HBV核酸的 探針的另一個末端標記淬滅基團。
[0016] 其中所述用于檢測HBV核酸的探針一個末端標記的熒光基團為FAM、R0X、CY5、 HEX、J0E、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET中的任意一種，但并不限于上述幾種；所述 用于檢測HBV核酸的探針另一個末端標記的淬滅基團為BHQ、TAMRA、MGB、DABCYL中的任意 一種，但并不限于上述幾種。
[0017] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于檢測HBV核酸的組合物。在一個實施方式 中，所述組合物為包含具有堿基序列SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的引物對以及具有堿基序 列SEQ ID NO. 5的探針；在另一個實施方式中，所述組合物包含具有堿基序列SEQ ID NO. 3 和SEQ ID NO. 4的引物對以及具有堿基序列SEQ ID NO. 6的探針；在再一個實施方式中，所 述組合物包含具有堿基序列SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2的引物對、具有堿基序列SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4的引物對和具有堿基序列SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6的探針。此 外，上述提供的組合物均還包含對HBV檢測無干擾的具有堿基序列SEQ ID NO. 7的內(nèi)標探 針，或者其反向互補序列。其中所述內(nèi)標探針的一個末端標記熒光基團，且該內(nèi)標探針的另 一個末端標記淬滅基團。其中所述內(nèi)標探針的末端標記的熒光基團為FAM、R0X、CY5、HEX、 J0E、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET中的任意一種，但并不限于上述幾種；且該內(nèi)標 探針的末端所標記的熒光基團不同于用于檢測HBV核酸的探針末端所標記的熒光基團，單 并不限于上述幾種。
[0018] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種用于檢測HBV核酸的試劑盒，該試劑盒包含至少 一種選自以下所述的引物組和/或至少一種選自以下所述的探針：
[0019] 所述至少一種選自以下所述的引物組為：
[0020] (1)引物組1，其包含具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列的引物；和
[0021] (2)引物組2,其包含具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO. 4 所示的核苷酸序列的引物。
[0022] 所述探針為至少一種選自以下的探針，或者包括至少一種以下序列的反向互補序 列：
[0023] (1)探針1，其具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；和
[0024] (2)探針2,其具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；
[0025] 以上所述探針的一個末端標記熒光基團，且另一個末端標記淬滅基團，其中熒光 基團為 FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET 中的任意一種，但并 不限于上述幾種；其中淬滅基團為BHQ、TAMRA、MGB、DABCYL中的任意一種，但并不限于上述 幾種。
[0026] 所述的用于檢測HBV核酸的試劑盒中還包含有一條對HBV的檢測無干擾的具有堿 基序列SEQ ID NO. 7的內(nèi)標探針，或者其反向互補序列，該內(nèi)標探針的一個末端標記熒光基 團，且該內(nèi)標探針的另一個末端標記淬滅基團；其中所述內(nèi)標探針的末端標記的熒光基團 為 FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET 中的任意一種，但并不限 于上述幾種；且該內(nèi)標探針的末端所標記的熒光基團不同于用于檢測HBV核酸的探針末端 所標記的熒光基團。該試劑盒還包含有內(nèi)標；PCR反應預混液；強陽性質(zhì)控品、臨界陽性質(zhì) 控品及陰性質(zhì)控品；和陽性定量參考品。其中所述PCR反應預混液包含有PCR緩沖液、DNA 聚合酶、UNG酶、dNTP和dUTP。
[0027] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測樣本中HBV核酸的方法，該方法包括下述步 驟：
[0028] (1)提取和純化樣本中的核酸：
[0029] (2)使用下述引物組進行特異性擴增和/或使用下述探針進行特異性檢測；
[0030] 其中引物組為包括至少一種選自以下所述的引物組：
[0031] (1)引物組1，其包含具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO. 2 所示的核苷酸序列的引物；和
[0032] (2)引物組2,其包含具有SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO. 4 所示的核苷酸序列的引物；
[0033] 其中所述探針為包括至少一種選自以下的探針，或者包括至少一種以下序列的反 向互補序列：
[0034] (1)探針1，其具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列；和
[0035] (2)探針2,其具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列；
[0036] 以上所述探針的一個末端標記熒光基團，且另一個末端標記淬滅基團，其中熒光 基團為 FAM、R0X、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXAS RED、VIC、TET 中的任意一種，但并 不限于上述幾種；其中淬滅基團為BHQ、TAMRA、MGB、DABCYL中的任意一種，但并不限于上述 幾種。以上所述特異性檢測為PCR檢測，優(yōu)選為熒光定量PCR檢測。
[0037] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：
[0038] 本發(fā)明提供了靈敏度高、假陰性率低、線性范圍廣、定量準確