通過莖環(huán)結(jié)構(gòu)阻斷3’dna末端的聚合酶延伸的方法
【專利說明】通過莖環(huán)結(jié)構(gòu)阻斷3' DNA末端的聚合酶延伸的方法
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年4月26日提交的美國臨時申請?zhí)?1/816, 431的優(yōu)先權(quán)，該申 請通過引用納入本文用于所有目的。
[0003] 聯(lián)邦資助的研究與開發(fā)下作出發(fā)明的權(quán)利聲明
[0004] 本發(fā)明部分得到NHGRI資助號：1R43HG005144-01的支持。聯(lián)邦政府可享有本發(fā) 明的某些權(quán)利。
【背景技術(shù)】
[0005] 核酸試驗通常采用DNA聚合酶，以及任選的具體DNA探針來生成試驗信號。例如， 試驗可采用標記的DNA寡核苷酸作為DNA聚合酶的引物。在這類試驗中，DNA引物的結(jié)合 和延伸在試驗結(jié)果的評估中起到作用。引物依賴性聚合酶試驗的潛在失效模式的一個示例 是在沒有引物雜交的情況下DNA聚合酶延伸的啟動。這種失效可源于DNA靶分子或擴增子 的自啟動或由混合物中其它模板分子的啟動。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本文提供了用于防止聚核酸的3'末端啟動聚合酶依賴反應的方法和組合物。該 方法包括向核酸的3'末端添加結(jié)構(gòu)以防止聚合酶延伸。
[0007] 在一些實施方式中，提供了一種引物延伸產(chǎn)物所致假啟動減少的進行引物延伸的 方法。在一些實施方式中，該方法包括：
[0008] 提供包含以下組分的反應混合物：
[0009] 包含5'末端和3'末端的單鏈多核苷酸模板，所述多核苷酸模板在3'末端的6個 核苷酸內(nèi)包含5-25個核苷酸的雙鏈莖；
[0010]引物，當該多核苷酸模板中存在靶序列則該云霧與該靶序列退火結(jié)合；和
[0011] 聚合酶；
[0012] 將反應混合物暴露于這樣的條件即該條件下，當該靶序列存在則該引物與該靶序 列退火且該聚合酶以模板依賴的方式延伸引物；并且
[0013] 檢測引物延伸產(chǎn)物的存在或量。
[0014] 在一些實施方式中，靶序列存在于多核苷酸模板中。
[0015] 在一些實施方式中，雙鏈莖是莖環(huán)的部分，雙鏈莖的兩條鏈由環(huán)連接。在一些實施 方式中，環(huán)包含1-10個核苷酸。在一些實施方式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多 核苷酸模板的3'末端。在一些實施方式中，雙鏈莖包含3'端并且連接到莖的3'端是1-5 個核苷酸，這些核苷酸不構(gòu)成莖的部分并且位于多核苷酸模板的3'末端。
[0016] 在一些實施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成雙鏈莖的第一條鏈，該 莖的第二條鏈是與之區(qū)分的與該核苷酸序列互補的反義寡核苷酸。在一些實施方式中，反 義寡核苷酸經(jīng)阻斷不被聚合酶延伸（例如，寡核苷酸不包含3' -OH部分）。在一些實施方 式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多核苷酸模板的3'末端。
[0017] 在一些實施方式中，多核苷酸模板包含猝滅劑/焚光標簽對中的一成員并且抑制 劑寡核苷酸與引物下游的多核苷酸模板退火，其中抑制劑寡核苷酸包含猝滅劑/熒光標簽 對中的第二員，由此，當抑制劑寡核苷酸與多核苷酸模板退火時，來自標簽的信號被猝滅。 在一些實施方式中，暴露包括用聚合酶來延伸引物，從而置換抑制劑寡核苷酸并使得猝滅 劑/熒光標簽對不猝滅從而生成熒光信號；并且檢測熒光信號并將信號的量與靶序列的存 在或量相關聯(lián)。
[0018] 在一些實施方式中，該聚合酶是DNA聚合酶。在一些實施方式中，該聚合酶是RNA 聚合酶。在一些實施方式中，反應混合物中的核苷酸三磷酸整合到引物延伸產(chǎn)物中并且所 述核苷酸三磷酸中的至少一些包含標簽。在一些實施方式中，核苷酸三磷酸包含熒光標簽 和猝滅劑對，這樣，當核苷酸三磷酸完整時，熒光標簽被猝滅劑猝滅，而當核苷酸整合到引 物延伸產(chǎn)物時熒光標簽不猝滅。
[0019] 也提供了包含5'末端和3'末端的單鏈多核苷酸，所述多核苷酸模板在3'末端的 6個核苷酸內(nèi)包含5-25個核苷酸的雙鏈莖。
[0020] 在一些實施方式中，雙鏈莖是莖環(huán)的部分，雙鏈莖的兩條鏈由環(huán)連接。在一些實施 方式中，環(huán)包含1-10個核苷酸。
[0021] 在一些實施方式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多核苷酸模板的3'末端。
[0022] 在一些實施方式中，雙鏈莖包含3'端并且連接到莖的3'端是1-5個核苷酸，這些 核苷酸不構(gòu)成莖的部分并且位于多核苷酸模板的3'末端。
[0023] 在一些實施方式中，由多核苷酸模板中的核苷酸序列形成雙鏈莖的第一條鏈，所 述莖的第二條鏈是與之區(qū)分的與核苷酸序列互補的反義寡核苷酸。在一些實施方式中，反 義寡核苷酸不包含3' -OH部分或者經(jīng)阻斷而不被聚合酶延伸。
[0024] 在一些實施方式中，雙鏈莖包含3'端并且莖的3'端毗連多核苷酸模板的3'末端。
[0025] 在一些實施方式中，多核苷酸模板包含猝滅劑/焚光標簽對中的一成員。
[0026] 在一些實施方式中，單鏈多核苷酸長10-5000個核苷酸。
[0027] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的單鏈多核苷酸的反應混合物。在一些實 施方式中，多核苷酸包含猝滅劑/熒光標簽對中的一成員并且反應混合物還包含抑制劑寡 核苷酸，其中抑制劑寡核苷酸包含猝滅劑/熒光標簽對中的第二員，由此，當抑制劑寡核苷 酸與多核苷酸退火時，來自標簽的信號被猝滅。在一些實施方式中，反應混合物還包含以下 中的至少一種（或全部）：DNA或RNA聚合酶；核苷酸三磷酸或脫氧核苷酸三磷酸；與單鏈多 核苷酸中的靶序列退火的引物；或抑制劑寡核苷酸，其中抑制劑寡核苷酸包含猝滅劑/熒 光標簽對中的第二成員，由此，當抑制劑寡核苷酸與多核苷酸退火時，來自標簽的信號被猝 滅。
[0028] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的單鏈多核苷酸的試劑盒。
[0029] 還提供了制備上述或本文其它地方所述的單鏈多核苷酸的方法。在一些實施方式 中，該方法包括將包含模板核酸的核酸樣品與DNA聚合酶和至少第一寡核苷酸引物接觸以 形成混合物，所述第一寡核苷酸引物包含莖環(huán)，所述引物具有5'末端和3'末端并且從5' 末端到3'末端包含：任選的5'末端處不形成莖環(huán)部分的1-6個核苷酸，之后是形成莖環(huán)的 前一半莖的核苷酸，之后是形成莖環(huán)的環(huán)的核苷酸，之后是形成與前一半莖環(huán)雜交的后一 半莖的核苷酸，之后是在3'末端處與模板核酸互補的序列；并且將混合物暴露于這樣的條 件，即所述條件下，使得第一寡核苷酸引物的3'末端與模板核酸退火并且DNA聚合酶以模 板依賴的方式延伸第一寡核苷酸引物的3'末端以形成包含模板核酸的互補物和第一寡核 苷酸引物的單鏈擴增子，從而擴增模板核酸。在一些實施方式中，混合物還包含含有與單鏈 擴增子互補的序列的第二寡核苷酸引物，并且其中暴露導致第二寡核苷酸引物與單鏈擴增 子退火并用DNA聚合酶延伸第二寡核苷酸引物以形成與單鏈擴增子互補并在多核苷酸的 5'末端處有莖環(huán)的多核苷酸，從而形成雙鏈擴增子。
[0030] 在一些實施方式中，第二寡核苷酸引物具有3'和5'末端，并且第二寡核苷酸引物 包含在第二寡核苷酸引物的5'末端的3個核苷酸內(nèi)結(jié)束的莖環(huán)。
[0031] 在一些實施方式中，暴露包括聚合酶鏈反應（PCR)。
[0032] 在一些實施方式中，第一或第二寡核苷酸包含標簽，使得雙鏈擴增子中的至少一 條鏈包含標簽。在一些實施方式中，標簽帶熒光。
[0033] 在一些實施方式中，第一或第二寡核苷酸引物包含猝滅劑，使得雙鏈擴增子中的 至少一條鏈包含猝滅劑。
[0034] 在一些實施方式中，莖的前一半和后一半各自有5-15個核苷酸。在一些實施方式 中，2-6個核苷酸形成莖環(huán)的環(huán)。在一些實施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處僅一 個核苷酸不形成莖環(huán)的部分。在一些實施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處的2個 核苷酸不形成莖環(huán)的部分。
[0035] 在一些實施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3'末端處并與模板核酸互補的序列 至少6個核苷酸長。
[0036] 還提供了包含莖環(huán)的寡核苷酸引物，所述引物具有5'末端和3'末端并且從5'末 端到3'末端包含：任選的5'末端處不形成莖環(huán)部分的1-6個核苷酸，之后是形成莖環(huán)的前 一半莖，之后是形成莖環(huán)的環(huán)的核苷酸，之后是與莖環(huán)的前一半反向互補的莖環(huán)的后一半 莖，之后是在3'末端處的序列（例如，與模板核酸互補）。
[0037] 在一些實施方式中，莖的前一半和后一半各自有5-15個核苷酸。在一些實施方式 中，2-6個核苷酸形成莖環(huán)的環(huán)。在一些實施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處僅一 個核苷酸不形成莖環(huán)的部分。在一些實施方式中，在第一寡核苷酸引物的5'末端處的2個 核苷酸不形成莖環(huán)的部分。在一些實施方式中，位于第一寡核苷酸引物的3'末端處并與模 板核酸互補的序列至少6個核苷酸長。
[0038] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的反應混合物。在一些實施方 式中，反應混合物還包含以下的一種或多種：DNA聚合酶；或具有與所述寡核苷酸引物不同 的序列的第二寡核苷酸。
[0039] 還提供了包含上述或本文其它地方所述的寡核苷酸的試劑盒。
[0040] 定義
[0041] 除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領域普通技術(shù)人員通常 所理解的含義。通常，本文所用的命名和下述細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、有機化學和核酸化學 以及雜交中的實驗室步驟均為本領域熟知和常用的。使用標準技術(shù)進行核酸和肽合成。按 照本領域和各種通用參考文獻所述的常規(guī)方法進行這些技術(shù)和步驟（通常參見，Sambrook 等，《分子克隆：實驗室手冊》（MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL)，第 2 版（1989) 冷泉港實驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，紐約冷泉港（Cold Spring Harbor，N. Y.)，其通過引用納入本文），將它們引入本文全文中。本文所用的命名以及下述 分析化學和有機合成中的實驗室步驟均為本領域熟知且常用。
[0042] 術(shù)語"擴增反應"指用于倍增核酸靶序列拷貝的任何體外方法。這類方法包括但 不限于聚合酶鏈反應（PCR)、DNA連接酶鏈反應（參見美國專利號4, 683, 195和4, 683, 202 ; 《PCR方案：方法和應用指南》(Innis等編，1990))、（LCR)、QBeta RNA復制酶、和基于RNA轉(zhuǎn) 錄（如TAS和3SR)的擴增反應以及本領域技術(shù)人員已知的其它反應。
[0043] "擴增"是指將溶解置于足以進行多核苷酸擴增的條件下的步驟（如果反應的所有 組分是完整的）。擴增反應的組分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。術(shù) 語"擴增"一般是指靶核酸的"指數(shù)"增長。然而，本文所用的"擴增"也可指核酸的選擇靶 序列數(shù)量的線性增長，如由循環(huán)測序所得。
[0044] 術(shù)語"擴增反應混合物"是指包含用于擴增靶核酸的各種試劑的水性溶液。這些 試劑包括酶、各種緩沖劑、鹽、擴增引物、靶核酸和三磷酸核苷。擴增反應混合物還可包含穩(wěn) 定劑和其它添加劑以優(yōu)化效率和特異性。根據(jù)上下文，混合物還可以是完整或不完整的擴 增反應混合物。
[0045] "聚合酶鏈反應"或"PCR"是指靶雙鏈DNA的特定區(qū)段或子序列以等比級數(shù)擴 增的一種方法。PCR是本領域技術(shù)人員所熟知的；參見例如，美國專利號4, 683, 195和 4, 683, 202 ;和《PCR方案：方法和應用指南》，Innis等編，1990。示例性PCR反應條件一般 包括兩個或三個步驟循環(huán)。兩步驟循環(huán)具有變性步驟，之后是雜交/延長步驟。三步驟循 環(huán)包括變性步驟，之后是雜交步驟，之后是分開的