一種利用溶劑分級(jí)結(jié)晶分離蝦青素單雙酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用溶劑分級(jí)冷卻結(jié)晶制備蝦 青素單酯和蝦青素雙酯的方法。 技術(shù)背景
[0002] 蝦青素以8七31311讓丨11，3,3'-二羥基-4,4-二酮基-0，0'-胡蘿卜素），是一種紅色酮 式類胡蘿卜素，發(fā)現(xiàn)于某些水生動(dòng)物體內(nèi)。據(jù)報(bào)道，蝦青素的抗氧化性比β-胡蘿卜素高10倍以 上，比維生素Ε高500倍以上，被稱為"超級(jí)維生素Ε"。蝦青素可作為著色劑應(yīng)用于貴重水產(chǎn) 品及禽類養(yǎng)殖以增加其附加商品值，此外，人體也可選擇性積累蝦青素，有抗氧化、抗衰老、 抗腫瘤、預(yù)防心腦血管疾病等功效。因此近年來(lái)受到廣泛關(guān)注。
[0003]因蝦青素具有抗氧化、抗炎、著色、光保護(hù)、促進(jìn)繁殖等多種生物學(xué)功能，近年來(lái)甚 受國(guó)內(nèi)外的食品、醫(yī)藥、化妝品、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在自然界中蝦青素90% 以上以酯化形式存在，酯化蝦青素較游離蝦青素穩(wěn)定。并且大多產(chǎn)品的制備、儲(chǔ)存和應(yīng)用均 以蝦青素酯的形式進(jìn)行。蝦青素、酯化蝦青素的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0004] SHOWALTERLA，CARD0UNEL1AJ，WADEAΝ等研究表明，隨著蝦青素酯化程度的加 深，蝦青素體現(xiàn)為疏水性增強(qiáng)，且更容易被動(dòng)物組織所吸收利用。在對(duì)龍蝦等動(dòng)物的研究 中，就證實(shí)酯化蝦青素比游離蝦青素容易被吸收并與外骨骼結(jié)合，從而使動(dòng)物有效著色。特 別值得關(guān)注的是，酯化蝦青素的形態(tài)對(duì)其穩(wěn)定性和吸收利用率具有重要影響，Harukazu FUKAMI等研究表明，單酯形式的類胡蘿卜素和雙酯形式的類胡蘿卜素在消化吸收特性方面存 在差異。因此，探索一條高效純化制備蝦青素單酯和蝦青素雙酯的工藝路線，對(duì)于研究不同 結(jié)合形態(tài)的蝦青素在理化性質(zhì)和消化吸收特性差異性具有重要意義，并且為蝦青素單酯和 雙酯的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明提供一種利用溶劑分級(jí)結(jié)晶純化蝦青素單酯和雙酯的方法，對(duì)蝦青素研究 與應(yīng)用推廣，以及帶動(dòng)藥保健品、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)以及家禽業(yè)等各方面的發(fā)展，具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種利用溶劑分級(jí)冷卻結(jié)晶分離蝦青素單酯和蝦青素雙酯的方法，能 夠有效的將蝦青素單酯和蝦青素雙酯從提取的蝦青素酯中分離出，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不 足。
[0007]本發(fā)明的方法，包括有如下的步驟：
[0008] 1)將蝦青素酯粗提物加入到無(wú)水乙醇中，在50~70°C條件下攪拌，至充分溶解，然 后將上述溶液體系置于35~38°C條件下靜止放置1~6h，然后經(jīng)離心或過(guò)濾，收集清液；
[0009] 2)將步驟1)收集得到的清液或?yàn)V液置于18~28°C條件下靜止放置1~6h，然后經(jīng) 離心或過(guò)濾，收集析出物；
[0010] 3)將步驟2)得到的析出物利用乙醇溶液洗滌1~3次，然后對(duì)析出物進(jìn)行干燥，得 到蝦青素雙酯，洗滌液經(jīng)回收循環(huán)利用；
[0011] 4)將步驟2)得到的離心清液或?yàn)V液置于4~15°C條件下，靜止1~6h后進(jìn)行離心或 過(guò)濾，收集析出物，所得清液或?yàn)V液返回步驟1或經(jīng)減壓回收重復(fù)利用；
[0012] 5)將步驟4)收集得到的析出物利用乙醇溶液洗滌1~3次，然后經(jīng)干燥得到蝦青素 單酯。
[0013]所述的蝦青素酯粗提物的制備方法如下：
[0014] 以雨生紅球藻、南極磷蝦、對(duì)蝦、蟹為原料，以乙醇、乙酸乙酯和正己烷中的一種或 幾種作為提取溶劑，按照料液比為1:3~20浸提1~24h，浸提結(jié)束后，經(jīng)過(guò)濾或離心收集浸 提液，然后浸提液經(jīng)減壓濃縮至無(wú)溶劑流出，回收浸提溶劑，得到的濃縮物即為蝦青素酯粗 提物。
[0015] 步驟3)所述洗滌用乙醇溶液為無(wú)水乙醇或體積分?jǐn)?shù)70~95%的乙醇水溶液，并且 洗滌用溶液的溫度在15~20°C。
[0016] 步驟5)所述洗滌用乙醇溶液為無(wú)水乙醇或體積分?jǐn)?shù)70~95%的乙醇水溶液，并且 洗滌用溶液的溫度控制在4~10°C。
[0017]本發(fā)明選用的溶劑飽和低級(jí)脂肪醇，是相對(duì)極性較強(qiáng)的溶劑，在適當(dāng)加熱的條件 下對(duì)蝦青素酯粗提物中各組分具有較好的溶解性，而隨著溫度的降低，對(duì)不同極性的組分 的溶解度變化差異較大，若在醇中加入適量的水，則可使溶劑的極性發(fā)生變化，更有利于蝦 青素酯的分離，而且，由于甘油和水的無(wú)限混溶性，使得蝦青素酯粗提物中的甘油更容易被 除去，同時(shí)，水的存在更利于除去體系中的高極性雜質(zhì)，如：葉綠素及其鹽，脂肪酸鹽等。而 醇對(duì)脂肪酸具有良好的溶解性，使得脂肪酸也可被除去。由此可見，利用飽和低級(jí)脂肪醇的 復(fù)合溶劑對(duì)蝦青素酯粗提物進(jìn)行分級(jí)結(jié)晶分離，可獲得良好的分離效果。本工藝流程簡(jiǎn)單， 無(wú)污染，易于工業(yè)化。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1:蝦青素、蝦青素單酯及蝦青素雙酯的結(jié)構(gòu)圖，其中R為飽和或不飽和的烴鏈；
[0019] 圖2:本發(fā)明的工藝流程圖；
[0020] 圖3:實(shí)施例2產(chǎn)物的TLC分析圖，其中1:雨生紅球藻粗提物，2:奸青素雙酯組分;3: 蝦青素單酯組分；
[0021] 圖4:實(shí)施例2產(chǎn)物的HPLC-DAD分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 申請(qǐng)人在長(zhǎng)期的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)控制冷析溫度能夠使蝦青素酯粗提物中大部分 的甘油酯析出，而只有少量的蝦青素酯析出，從而達(dá)到從蝦青素酯粗提物中除去甘油酯的 目的;進(jìn)一步通過(guò)控制冷析溫度，可使蝦青素二酯和蝦青素單酯分級(jí)析出。
[0023] 以下采用實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段 來(lái)解決技術(shù)問(wèn)題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過(guò)程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。蝦青素單酯和雙酯 的定性定量分析：
[0024]本發(fā)明采用薄板層析法和高效液相色譜法對(duì)蝦青素酯粗提物在分級(jí)結(jié)晶分離過(guò) 程中的各組分析出物進(jìn)行定性、定量分析檢測(cè)。
[0025]TLC分析
[0026] 實(shí)驗(yàn)步驟：準(zhǔn)確稱取10 .Omg樣品，加入10ml二氯甲烷溶解，震蕩提取lOmin;在 6000r/min條件下離心30min，取上清液點(diǎn)樣；以正己燒:丙酮=4:1(V/V)配制展開劑60ml， 置于展開槽中平衡；以Φ3_的點(diǎn)樣毛細(xì)管點(diǎn)樣，展開，其間觀察并記錄現(xiàn)象。
[0027] HPLC分析
[0028] 準(zhǔn)確稱取2.Omg樣品，加入10ml色譜純二氯甲烷溶解，經(jīng)0.22μπι有機(jī)膜過(guò)濾，然后 進(jìn)行HP