用于培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的含有特異氨基酸的培養(yǎng)基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物領域，特別的，屬于采用培養(yǎng)方法來培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的 培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] 鐵皮石斛(DendrobiumSw.)又名黑節(jié)草、云南鐵皮，是蘭科(Orchidaceae)多年生 附生草本植物，是一種珍貴的中藥材。早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載，具有滋陰清熱、生津 益胃、潤肺止咳、明目強身、鎮(zhèn)痛消炎的功效。同時現(xiàn)代研究表明，石斛藥材除具有本草記載 的等功效外，還具有抗腫瘤、抗輻射、抗血小板凝集及增強機體免疫力等功效。近年來石斛 藥材的需求量不斷增加，而栽培技術的不斷創(chuàng)新使得人工種植石斛的面積不斷增大，然而 隨著集中種植面積的增加，出現(xiàn)的問題也不斷增多，石斛種植出現(xiàn)多種不同的病害，例如鐵 皮石斛褐斑病。石斛葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點，后小點漸漸擴大為約5~ 6mm的病斑。這不僅影響石斛的品質，也影響石斛的產(chǎn)量，具統(tǒng)計褐斑病導致產(chǎn)量損失5 % -10%。防止褐斑病的發(fā)生和擴增有助于提高石斛生產(chǎn)的產(chǎn)量和品質，確保石斛產(chǎn)業(yè)健康有 序的發(fā)展。為了研究如何防治鐵皮石斛的褐斑病，就需要首先培養(yǎng)褐斑病來進行一些方面 的研究，例如研究該病菌的生物學特性，藥效試驗等篩選出合適的藥物進行防治。但是，這 種病菌難以培養(yǎng)，而且產(chǎn)量低，為此，需要提供如何高效率的培養(yǎng)褐斑病病菌進行相關方面 的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決以上問題，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的方法，該方法包括： 提供草莓煎汁培養(yǎng)基，其中該草莓煎汁培養(yǎng)基的組成為:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g， 添加水至l〇〇〇ml。
[0004] 優(yōu)選的，草莓莖葉200g經(jīng)過如下過程進行制備：在煎鍋中放入1000mL蒸餾水和 200g草莓莖葉，煮沸5min后，過濾去除莖葉，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0005] 優(yōu)選的，培養(yǎng)的PH值為7.
[0006] 優(yōu)選的，培養(yǎng)的溫度為25-30攝氏度。
[0007] 優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多P彖莖點霉（Phomamultirostrata (Mathuretal·)Dorenboseh&Boerema)〇
[0008] 另一方面，本發(fā)明提供草莓煎汁培養(yǎng)基在制作培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌培養(yǎng)基中的 用途，其中所述的草莓煎汁培養(yǎng)基由下列組分組成:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g。
[0009] 優(yōu)選的，優(yōu)選的，草莓莖葉200g經(jīng)過如下過程進行制備:在煎鍋中放入1000mL蒸餾 水和200g草莓莖葉，煮沸5min，過濾去除莖葉，加入20g蔗糖，定容至1000mL。
[0010] 優(yōu)選的，培養(yǎng)的PH值為7。
[0011]優(yōu)選的，培養(yǎng)的溫度為25-30攝氏度。
[0012]優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多卩彖莖點霉（Phomamultirostrata (Mathuretal.)Dorenboseh&Boerema)〇
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌的方法，該方法包括提供一種 培養(yǎng)基，該培養(yǎng)的組成如下：氮源化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯 化鉀0.5g，硫酸亞鐵O.Olg，糖源物質30g，瓊脂20g，添加水至1000mL，其中所述的糖源物質 為麥芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纖維乙糖。
[0014]優(yōu)選的，糖源物質為纖維乙糖。
[0015]優(yōu)選的，所述的氮源化合物為L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸或硝酸 鉀。
[0016]優(yōu)選的，所述的氮源化合物為L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。
[0017] -種培養(yǎng)基在用于制備培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌培養(yǎng)基中的用途，其中，所述的培 養(yǎng)基的組成如下:氮源(氨基酸)化合物3g，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂(MgS04 · 7H20)0.5g，氯化 鉀〇.5g，硫酸亞鐵O.Olg，糖源物質30g，瓊脂20g，其中所述的糖源物質為麥芽糖、蔗糖、菊 糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇或纖維乙糖。
[0018]優(yōu)選的，糖源物質為纖維乙糖。
[0019]優(yōu)選的，所述的氨基酸化合物為L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸。
[0020]優(yōu)選的，所述的氨基酸化合物為L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸。
[0021]優(yōu)選的，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多卩彖莖點霉（Phomamultirostrata(Mathuretal·)Dorenboseh&Boerema)〇
[0022] 有效效果
[0023]通過本發(fā)明的特異培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，可以獲得優(yōu)質、大量的褐斑病菌，為研究褐 斑病菌提供了有益的材料，特別是可以提供大量的孢子。
[0024]具體實施例子
[0025] 1材料與方法
[0026] 1.1鐵皮石斛褐斑病病樣采集及病原菌的分離
[0027]田間鐵皮石斛褐斑病病樣采集于浙江省樂清縣雁蕩山鎮(zhèn)的樂清鐵楓堂鐵皮石斛 基地、樂清同豐鐵皮石斛基地、樂清靈巖鐵皮石斛基地;采樣后將標樣放入保鮮袋帶回實驗 室置于5°C冰箱，待用。切取鐵皮石斛褐斑病鏡檢并用PSA培養(yǎng)基分別于進行常規(guī)組織分離 和劃線分離。
[0028] 1.2致病性測定
[0029]分別采用分離自鐵皮石斛褐斑病病樣分離物的菌絲和分生孢子液(稀釋成IX106 個/mL)，對石斛進行嫩枝活體傷口和無傷接種，在25°C的XT5401-CD275TJH智能生物人工氣 候箱內(nèi)，RH98%以上，12小時光照12小時黑暗接種后培養(yǎng)，以健康的枝條為對照，重復3次， 每天定時觀察記錄發(fā)病情況，分析致病性。
[0030] 1.3病原菌的培養(yǎng)性狀
[0031] 病原菌接種于PSA上于25°C培養(yǎng)7d，記錄菌落形態(tài)，顏色;測量100個分生孢子的大 小，
[0032]重復3次，記錄平均值。
[0033] 1.3.1不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛褐斑病病原菌菌絲生長及分生孢子產(chǎn)生的影響。
[0034]病原菌于25°C用下表中的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每處理重復6次，5d后測量菌落直徑，菌絲 干重、分生孢子器的產(chǎn)生情況、及其菌落色澤等。
[0035] 表1:不同培養(yǎng)基的配方
[0036]
[0037] *煎汁培養(yǎng)基的準備過程：在煎鍋中放入1000mL蒸餾水和200g相應的物品，煮沸 5min后，過濾留濾液，加入20g鹿糖，定容至1000mL。
[0038] 1.3.2，針對最優(yōu)選的培養(yǎng)基(草莓煎汁培養(yǎng)基），我們確定不同pH值對鐵皮石斛褐 斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響將直徑4.0mm的菌絲塊移于pH值4-12的不同pH值的草莓 煎汁培養(yǎng)基上(pH值采用pHS-9V酸度計測量配制），置于25°C培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測 量菌落干重，計算分生孢子數(shù)量。
[0039] 1.3.3不同溫度對鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響將直徑4.0mm的 菌絲塊移于草莓煎汁培養(yǎng)基平板上，置于5°C，10°C，15°C，20°C，25°C，30°C，35°C不同溫度 下培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑和分生孢子數(shù)量。
[0040] 1.3.4不同碳源對鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響。
[0041]經(jīng)過我們的大量研究，發(fā)現(xiàn)，當以草莓煎汁培養(yǎng)基來研究最佳碳源和氮源對該病 菌培養(yǎng)的影響的時候，發(fā)現(xiàn)不同的碳源對培養(yǎng)的性狀(菌落干重和產(chǎn)孢情況)并沒有實質的 差異，也就是說不同的碳源或氮源似乎起到同樣的作用，沒有實質的改善和影響，同樣，在 其他類似的培養(yǎng)基上，例如樹皮煎汁培養(yǎng)基，甘蔗煎汁培養(yǎng)基，荷葉煎汁培養(yǎng)基，燕麥培養(yǎng) 基(0MA培養(yǎng)基)獲得與草莓煎汁培養(yǎng)基類似的結果(具體數(shù)據(jù)略）。
[0042]相反，查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，再分別用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、可溶淀粉、半乳 糖、海藻糖、甘露醇、木糖、DEAE纖維素、乙醇、核糖、果糖、山梨糖、山梨醇、鼠李糖、菊糖、乳 糖、麥芽糖、纖維素鈉、纖維乙糖等20種不同碳源等量置換蔗糖(含量與蔗糖一樣），于25°C 下培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑，觀察菌落干重和產(chǎn)孢情況，獲得了不同的結 果，具體見結果分析。
[0043] 1.3.5不同氮源對鐵皮石斛褐斑病菌菌絲生長及分生孢子的影響。
[0044]以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用谷氨酸、谷氨酰氨、天門冬酰氨、天門冬氨酸、 甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、酪氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-蛋氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、酪 蛋白水解物、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、亞硝酸鈉等26種氮源等量置換硝酸鉀或硝酸鈉(質量與 硝酸鉀一樣），置于25°C培養(yǎng)，每處理重復6次，6d后測量菌落直徑，觀察菌落干重和產(chǎn)孢情 況。
[0045] 2.0結果與分析
[0046] 2.1鐵皮石斛褐斑病的癥狀
[0047]褐斑病僅侵染鐵皮石斛的葉片。葉片染病后病斑初呈淡褐色至黑褐色的小點，后 小點漸漸擴大，最大病斑約5~6mm。病斑圓形或橢圓形，淡褐色至黑褐色，有時病健交界處 常有一圈褐色的暈圈。病斑中間凹陷。嚴重時，葉片上出現(xiàn)許多大小不一的病斑，一般新葉 不染病。
[0048] 2.2病原菌的分離和致病性測定
[0049]對幾十個石斛褐斑病標樣進行劃線分離和常規(guī)組織分離，5d后，培養(yǎng)皿上長出少 量細菌和不同的真菌，將這些細菌和真菌置于適宜的溫濕度條件下對在相同鐵皮石斛健康 的枝葉進行柯赫法則檢驗，發(fā)現(xiàn)這些細菌大都為芽孢桿菌，均為非致病菌;其中重復分離到 的一種真菌分離物為疑似病原物。將這種真菌分離物置于適宜的溫濕度條件下在相同鐵皮 石斛健康的枝葉進行接種檢驗，這些真菌分離物均對石斛葉致病，發(fā)病病癥與田間基本一 致，通過分子生物方法鑒定為即為石斛褐斑病病原菌。
[0050] 2.3病原菌分離物的形態(tài)及培養(yǎng)性狀
[0051]病原菌在PSA上，菌絲成放射狀生長，氣生菌絲灰白色，短絨毛狀，較發(fā)達。平鋪于 培養(yǎng)基上，初期菌落(尤其在其邊緣)為淡淡的粉紅色，隨即轉為灰色，再由灰色轉為褐色， 最后由褐色轉為黑褐色，菌落也