一株防治植物根癌病的蒼白桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)、林和園藝作物保護技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及防治植物根癌病病的生防 細(xì)菌及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 根癌病是由根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)引起的一種常見細(xì)菌性 病害。根癌土壤桿菌的寄主范圍很廣，能侵染93科、331屬的643種植物（DeCleene，et al.，1981)。在歐洲、北美、南非及亞洲等一些國家普遍發(fā)生。而在我國較為嚴(yán)重的根癌病 發(fā)生區(qū)域為河北、山東、遼寧、河南、湖北、江蘇等省區(qū)（馬德飲和王慧敏，1995)。其中核果 類、漿果類、仁果類、堅果類果樹以及一些林木和花卉受害較為嚴(yán)重，桃樹幼苗受害后早衰， 植株矮化，甚至死亡；成齡樹感染此病后會生長不良、樹勢變?nèi)酢⒐麑嵭?、產(chǎn)量低、樹齡縮短 (尹玲莉，2009)，造成了重大的經(jīng)濟損失。目前對根癌病最有效的防治措施是輪作和生物防 治。但許多果園或苗圃無法實行常年輪作。提前使用生物菌劑是降低病原菌進入植物體內(nèi) 并干擾其代謝的有效措施。本技術(shù)投入低、效率高，是一項農(nóng)民認(rèn)可的、可操作強的農(nóng)產(chǎn)品 生產(chǎn)技術(shù)。
[0003] 因根癌土壤桿菌具有三種不同的生物型，其中III型為A.vitis，一般只侵染葡 萄；而I型和II型根癌土壤桿菌（A.tumefaciens)可侵染多種核果類和堅果類果樹以及 其他林木、花卉和雙子葉植物，危害更為廣泛。前人研究報道對核果類果樹根癌病有效的 生防菌對葡萄根癌病防效較差，而對葡萄根癌病有效的生防菌對核果類果樹根癌病防效也 比較差。目前僅生防菌1^84(厶.抑(1;[(^&(^61')(1(61'1'，1972，]\1〇〇代6七311979)或1(1026 已 經(jīng)在澳大利亞和美國登記注冊（商品名為Nogall)。已報道的其他生防菌株還有：防治桉 樹根癌病的根癌土壤桿菌無毒株D286 (Hendson，1983)、防治葡萄根癌病的生防菌E26 (A. vitis)(梁亞杰等 1990)、HLB_2(A.radiobacter) (Pu&Goodman，1993 ;游積峰等，1990)和 MI15(A.radiobacter)(謝學(xué)梅等，1984)、防治櫻桃和梨根癌病的生防菌UHFBA-8和11 (A. radiobacter) (Gupta等，2010)。上述生防菌都屬于土壤桿菌屬細(xì)菌，其他屬生防菌還有菌 根真菌（宋福強等，2005)、放線菌（梁靜等，2008 ;季敬霖等，2011)、假單孢菌（張春明等， 1988,1991)、芽孢桿菌提取物（Hammami等，2009)等，但未商品化。因此針對在果樹和其他 植物上發(fā)生普遍的由A.tumefaciens引起的根癌病，獲得具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的生防菌 及其無細(xì)胞制劑對根癌病的防控具有重要的實際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種防治植物根癌病的拮抗細(xì)菌，該拮抗細(xì)菌分離于山東 省泰安市桃樹根際，對根癌病菌A.tumefaciens具有明顯的措抗作用，并抑制根癌病菌 A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供本發(fā)明的可抑制根癌病發(fā)生的拮抗細(xì)菌的用途，其用途 是防治由A.tumefaciens引起的植物根癌病。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供的一株根癌病拮抗菌，其特征在于，該拮抗菌的分類命名為蒼白桿菌 (Ochrobactrumoryzae)，于2014年9月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心（CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNo. 9634。
[0008] 該拮抗菌（2#)經(jīng)形態(tài)、生理生化和16SrDNA序列同源性分析鑒定為蒼白桿菌 Ochrobactrumoryzae，2#菌株在ρΗ7· 0-7. 5,溫度28_35°C生長良好，可利用多種碳源生長。
[0009] 采用平板拮抗法測定該菌株的抗菌性能，發(fā)現(xiàn)2#菌株在YEB培養(yǎng)基上并不抑制根 癌土壤桿菌A.tumefaciens的生長，但菌體生長速度很快，菌落粘稠。分別以向日葵和番爺 作為感病植物，采用生物測定的方法，測定2#菌株對A.tumefaciens在植物上形成根癌瘤 的抑制作用，結(jié)果表明：將lOkfuml1的2#菌株的菌懸液和A.tumefaciens菌懸液以10 : 1 的體積比混和，接種向日葵7天后，調(diào)查結(jié)果表明，2#菌株處理可顯著抑制根癌瘤的形成，對 根癌病的防效為78. 1%。將100ml濃度為106cfuml1的2#菌株菌懸液提前澆灌番茄苗， 1天后燒灌同樣體積同樣濃度的A.tumefaciens菌懸液，可大大降低番爺上根癌瘤的形成， 防效為94. 9%。
[0010] 本發(fā)明的可防治植物根癌病的蒼白桿菌的篩選：
[0011] 采集泰安桃園中桃樹的根、莖和根際土，采用選擇性培養(yǎng)基（NewKerr培養(yǎng)基）， 稀釋涂布法對細(xì)菌進行分離。采用virD2A/virD2C引物5'-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3'， 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3'(Hass，.etal.，1995)和Tip6F/Tip6R引物： 5' -GGTCTAATGCGCAGAGGTGT-3, 5' -CGGCTCAAGGATTAGACAGG-3' (Yakabe，2012)，對所分離細(xì) 菌的vir區(qū)及T-DNA區(qū)進行測定，選擇未擴增到224bp和243bp目的片段的菌株作為非致 病待測菌株。將A.tumefaciens菌懸液加入YEB培養(yǎng)基，然后點接待測菌株，28°C培養(yǎng)72h 后，發(fā)現(xiàn)一株不產(chǎn)生抑菌圈，但落顏色不同于前人報道的根癌土壤桿菌，而且生長迅速的菌 株。因該菌可在選擇性培養(yǎng)基上生長，與根癌土壤桿菌的營養(yǎng)需求有相同之處，因此認(rèn)為是 一株有潛力的拮抗菌，將該菌株定名為2#。以向日葵為感病植物，采用將在NB培養(yǎng)液中培 養(yǎng)的2#菌株的菌懸液和A.tunefaciens菌懸液（106cfuml^以體積比10 :1的比例混和后 接種的方法，測定2#菌株對A.tumefaciens在向日葵上形成根癌瘤的抑制作用，接種7天 后，調(diào)查發(fā)現(xiàn)2#菌株處理比單獨接種A.tumefaciens的向日葵苗上根癌瘤明顯減少，癌瘤 變小，對根癌病的防效可達到78. 1%。以番茄為感病植物，模擬田間種植模式，在中國農(nóng)業(yè) 科學(xué)院植物保護研究所廊坊基地對2#菌株的防病效果進行了確認(rèn)。在番茄移栽時，劃傷番 茄幼苗莖基部，用濃度為l〇6cfuml1的2#菌株的菌懸液蘸根，每株番茄苗再澆灌100ml，1 天后澆灌同樣體積同樣濃度的A.tumefaciens菌懸液，2個月后調(diào)查，發(fā)現(xiàn)2#菌株菌懸液處 理可大大降低番茄莖基部根癌瘤的形成，癌瘤直徑大幅度減小，防效為94. 9%。
[0012] 所述的細(xì)菌vir區(qū)的擴增體系（總體積：25· 0μL)為：DNA模板0· 6μL( < 1μg)、 上下游弓丨物（5pmol/yL)各 1.0yL、10X緩沖液 2.5yL、dNTPMixture(2.5mM each) 1· 5μL、Taq聚合酶（2. 5u/μL) 0· 5μL、超純水 18. 0μL〇
[0013]PCR擴增條件：95°C預(yù)變性