雙基因敲除重組紅球菌、構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物基因工程領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及雙基因敲除重組紅球菌及 其構(gòu)建方法，更具體的，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建雙基因敲除的紅球菌的構(gòu)建方法、一種雙基因 敲除重組紅球菌、一種構(gòu)建高表達(dá)腈水解酶重組紅球菌的方法、一種高表達(dá)腈水解酶重組 紅球菌、高表達(dá)腈水解酶重組紅球菌在制備羧酸類化合物中的用途以及一種制備丙烯酸銨 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紅球菌是一種好氧的革蘭氏陽性放線菌，具有相對(duì)較快的生長(zhǎng)速率。由于具有強(qiáng) 大的酶和代謝物合成能力，以及對(duì)有機(jī)溶劑的良好耐受性，紅球菌廣泛應(yīng)用于化學(xué)品、醫(yī)藥 產(chǎn)品等的生物制備。尤其是高表達(dá)腈水合酶的紅色(赤)紅球菌(Rhodococcus ruber)或紫 紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)游離細(xì)胞，已經(jīng)成功用于丙稀酰胺、煙酰胺等化學(xué)品 的工業(yè)生物催化生產(chǎn)。
[0003] 腈水解酶(Nitrilase)、酰胺酶(Amidase)和腈水合酶(Nitrilehydratase)，是腈 代謝酶系的三種典型工業(yè)酶，廣泛用于合成各種重要化學(xué)品和醫(yī)藥中間體。例如，微生物腈 水解酶可以直接催化一分子丙烯腈與兩分子水發(fā)生水合反應(yīng)，生成丙烯酸和氨(趙孝先等， 山東大學(xué)學(xué)報(bào)，1994,29(2):43~46)，在中性和弱酸、弱堿性溶液中都表現(xiàn)為丙稀酸銨。該 催化反應(yīng)在常溫常壓下進(jìn)行，能耗低，操作簡(jiǎn)單、安全;丙烯腈轉(zhuǎn)化率高，生成產(chǎn)物單一。此 外，腈水解酶還用于利普妥藥物中間體、苦杏仁酸、苯甲酸、羥基乙酸等產(chǎn)品的生物合成。因 此，對(duì)于腈水解酶的結(jié)構(gòu)、性能和應(yīng)用研究也受到廣泛重視（徐建妙等，微生物學(xué)通報(bào)， 2005,32(5): 141~146)。第一個(gè)能產(chǎn)腈水解酶的微生物菌種是由Hook和Robinson利用天然 腈化合物蓖麻堿作為唯一碳源篩選得到的假單胞菌(Pseudomonas)，此后有許多研究者利 用特定的腈化合物作為唯一碳源或者唯一氮源篩選到一系列能產(chǎn)腈水解酶的細(xì)菌和真菌。 日本利用紫紅紅球菌R.rhodochrousJ1產(chǎn)生的腈水解酶催化丙稀腈生產(chǎn)丙稀酸，在丙稀腈 濃度較低的條件下，其腈水解酶酶活為18.4U/mL，經(jīng)過連續(xù)24小時(shí)的補(bǔ)加丙烯腈進(jìn)行催化， 丙稀酸的濃度累積到3928凡(似8&8&￥&，6七&1.41'(：11]\1;[(31'013；[01，1988，150:89~94)。王鐵 鋼等人則對(duì)菌株R.rhodochroustgl-A6進(jìn)行了紫外誘變和培養(yǎng)基優(yōu)化，腈水解酶活性達(dá)到 26.77U/mL，經(jīng)過10小時(shí)的補(bǔ)加丙烯腈連續(xù)催化，丙烯酸累積濃度達(dá)到414.2g/L(羅暉等，現(xiàn) 代化工，2006,26(S2):109~113;王鐵鋼等，生物加工過程，2007,5(1):41~44)。
[0004] 與腈水解酶相比，腈水合酶的研究更為廣泛，且腈水合酶催化生產(chǎn)丙烯酰胺的生 物路線已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。在紅色紅球菌TH中，腈水合酶的表達(dá)量可高達(dá)總蛋白量 的80 %左右。
[0005] 由于成本、原料價(jià)格、腈水解酶活性和催化工藝等因素的影響，采用腈水解酶催化 的生物法生產(chǎn)丙烯酸(銨）尚未普遍應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一或至少提供一種商業(yè)選擇。
[0007] 依據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建雙基因敲除的重組紅球菌的方法，包 括步驟：（1)根據(jù)所述紅球菌的腈水合酶基因序列，設(shè)計(jì)引物以分別擴(kuò)增所述腈水合酶基因 的上游序列和所述腈水合酶基因的下游序列，獲得所述腈水合酶基因的上游片段和所述腈 水合酶基因的下游片段；（2)將（1)中的腈水合酶基因的上游片段和腈水合酶基因的下游片 段插入到自殺質(zhì)粒中，獲得重組自殺質(zhì)粒，所述自殺質(zhì)粒攜帶卡那霉素抗性基因和蔗糖果 聚糖酶基因；（3)利用(2)中的重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化敲除了酰胺酶基因的重組紅球菌的感受態(tài) 細(xì)胞，獲得所述雙基因敲除的重組紅球菌，其中包括，通過卡那霉素抗性進(jìn)行第一輪篩選， 獲得第一重組菌落，通過蔗糖平板對(duì)所述第一重組菌落進(jìn)行第二輪篩選，以獲得所述雙基 因敲除的重組紅球菌。
[0008] 利用上述本發(fā)明的這一方面的方法，能夠高效的構(gòu)建出雙基因敲除的重組紅球 菌，即高效的構(gòu)建出同時(shí)敲除了酰胺酶基因和腈水合酶基因的重組紅球菌。構(gòu)建出的該雙 基因敲除的重組紅球菌可以作為宿主細(xì)胞，用于插入目的基因片段使目的基因得以高效表 達(dá)。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述本發(fā)明一方面的構(gòu)建雙基因敲除的重組紅球菌的方法 還可以具有以下附加技術(shù)特征至少之一：
[0010] 所稱的紅球菌可以選自目前已知的紅球菌，本發(fā)明對(duì)此不作限制。根據(jù)本發(fā)明的 一個(gè)實(shí)施例，所稱的紅球菌選自紅色紅球菌紅色紅球菌RhodococcusruberTH(R.ruber ΤΗ)和TH3中的一種。紅色紅球菌R.ruberΤΗ和TH3的生長(zhǎng)周期短、酶的表達(dá)效率高、工業(yè)化 生產(chǎn)工藝成熟，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。此外，在紅色紅球菌ΤΗ和ΤΗ3中，天然的腈水解酶 基因幾乎不表達(dá)，腈水解酶活性幾乎為零。
[0011]所稱的自殺質(zhì)粒(suicideplasmid)，通常為R質(zhì)粒的衍生質(zhì)粒，常有宿主范圍廣 的特點(diǎn)，具有接合轉(zhuǎn)移基因。它的復(fù)制需要一種特殊的蛋白，大多數(shù)細(xì)菌不產(chǎn)生這種蛋白 質(zhì)，因此，當(dāng)進(jìn)入寄主細(xì)胞時(shí)，要么不能復(fù)制、被消除，要么被整合入染色體上，和染色體一 起復(fù)制。利用自殺質(zhì)粒的這個(gè)特點(diǎn)，將基因工程技術(shù)構(gòu)建的基因缺失的DNA片段，克隆入自 殺質(zhì)粒，利用缺失基因兩端的同源片段，定位自殺質(zhì)粒的整合位點(diǎn)。利用同源性DNA片段可 發(fā)生重組的原理，構(gòu)建精確基因缺失菌株。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，（2)中的自殺質(zhì)粒選 自pkl8mob_sacB和其衍生質(zhì)粒中的一種。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所稱的敲除了酰胺酶基因的重組紅球菌為敲除了酰胺 酶基因的TH3紅色紅球菌，可表示為TH3(amdA-）。該工程菌株是清華大學(xué)為了減少紅球菌 TH腈水合酶催化丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺過程中的副產(chǎn)物(丙烯酸)積累，采用同源單交換重組 的方法，敲除了染色體上的酰胺酶基因獲得的基因工程菌株(ZL200880000969.1;W02009/ 117843;US12/933，725)。將TH3(amdA-）菌株用于催化生產(chǎn)丙烯酰胺，副產(chǎn)物丙烯酸的生成 量降低了80% 以上（Maetal.Bioresourcetechnology，2010,101(1):285_291)〇
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，（1)中的腈水合酶基因的上游片段帶有酶切位點(diǎn) EcoRI/XbaI，（l)中獲得的腈水合酶基因的下游片段帶有酶切位點(diǎn)Xbal/Hindlll。使得在步 驟(2)中，能夠通過雙酶切將腈水合酶基因的上游片段和下游片段插入到自殺質(zhì)粒中。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例，（1)中的擴(kuò)增所述腈水合酶基因的上游片段的引 物具有如SEQIDNO: 1和2所示的序列，所述腈水合酶基因的上游片段具有如SEQIDN0:3 所示的序列，和/或（1)中的擴(kuò)增所述腈水合酶基因的下游片段的引物具有如SEQIDN0:4 和5所示的序列，所述腈水合酶基因的下游片段具有如SEQIDN0:6所示的序列。通過上述 設(shè)計(jì)的特定的引物引入酶切位點(diǎn)，使獲得的上下游片段分別帶有EcoRI/Xba頂每切位點(diǎn)和 Xbal/Hindin酶切位點(diǎn)。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，（3)為利用電穿孔進(jìn)行所述重組自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例，（3)中的通過卡那霉素抗性進(jìn)行第一輪篩選，獲得 第一重組菌落，包括:利用含卡那霉素20微克/毫升的LB固體平板進(jìn)行所述第一輪篩選，獲 得在所述卡那霉素20微克/毫升的LB固體平板上生長(zhǎng)的紅色菌落為所稱第一重組菌落。含 卡那霉素的平板上出現(xiàn)紅色菌落，說明質(zhì)粒上攜帶的腈水合酶基因上下游片段已經(jīng)和染色 體發(fā)生單交換同源重組，攜帶卡納霉素抗性基因的自殺質(zhì)?；虿迦肓巳旧w。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例，（3)中的通過蔗糖平板對(duì)所述第一重組菌落進(jìn)行 第二輪篩選，以獲得所述雙基因敲除的重組紅球菌，包括:利用含蔗糖10%的LB固相平板對(duì) 所述紅色菌落進(jìn)行所述第二輪篩選，獲得在含蔗糖10%的LB固相平板上生長(zhǎng)的菌落;分別 通過含卡那霉素20微克/毫升的LB固體平板和不含卡那霉素的LB固相平板對(duì)所述在含蔗糖 10%的LB固相平板上生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行篩選，獲得在所述含卡那霉素20微克/毫升的LB固體 平板上不生長(zhǎng)、在所述不含卡那霉素的LB固體平板上生長(zhǎng)的菌落為所述雙基因敲除的重組 紅球菌。隨機(jī)挑選3個(gè)預(yù)計(jì)為雙基因敲除的菌落進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果顯示菌落染色體 上沒有酰胺酶和腈水合酶，證實(shí)為雙基因敲除菌，說明酰胺酶-腈水合酶基因敲除型重組紅 色紅球菌THdAdN構(gòu)建以及篩選成功。
[0018] 依據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種雙基因敲除的重組紅球菌，其利用上述本發(fā)明 一方面或者任一實(shí)施例中的構(gòu)建雙基因敲除的重組紅球菌的方法構(gòu)建獲得。該雙基因敲除 的重組紅球菌可以作為宿主細(xì)胞，用于插入目的基因片段使目的基因得以高效表達(dá)。
[0019]依據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種構(gòu)建高表達(dá)腈水解酶重組紅球菌的方法，該方 法包括:構(gòu)建尚表達(dá)臆水解酶的質(zhì)粒，獲得尚表達(dá)臆水解酶質(zhì)粒;利用所述尚表達(dá)臆水解酶 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化雙基因敲除的重組紅球菌的感受態(tài)細(xì)胞，以獲得所述高表達(dá)腈水解酶重組紅球 菌，所述雙基因敲除的重組紅球菌利用上述本發(fā)明一方面或者任一實(shí)施例中的構(gòu)建雙基因 敲除的重組紅球菌的方法構(gòu)建獲得。
[0020] 本發(fā)明的這一方面的方法，利用上述本發(fā)明一方面或者任一實(shí)施例的方法構(gòu)建的 雙基因敲除的重組紅球菌可以作為宿主細(xì)胞，利用克隆高表達(dá)腈水解酶基因以及構(gòu)建高表 達(dá)腈水解酶的質(zhì)粒，將高表達(dá)腈水解酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中，使獲得能夠高表達(dá)腈水 解酶的重組紅球菌。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述構(gòu)建高表達(dá)腈水解酶的質(zhì)粒包括:設(shè)計(jì)引物對(duì)以擴(kuò)增 紫紅紅球菌的腈水解酶基因，獲得腈水解酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物;將所述腈水解酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物 插入到大腸桿菌-紅球菌穿梭質(zhì)粒中，以獲得所述高表達(dá)腈水解酶質(zhì)粒。
[0022] 所稱穿梭質(zhì)粒是指一類人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可以 在兩種不同類群宿主中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。此概念不僅用于不同的微生物菌群之間， 也可以推廣到真核生物表達(dá)載體的構(gòu)建，如用于枯草的PBE2、酵母的pPIC9K、哺乳動(dòng)物表達(dá) 載體pMT2和用于植物細(xì)胞的Ti質(zhì)粒。這些穿梭質(zhì)粒不僅可以在大腸桿菌中復(fù)制擴(kuò)增，也可 以在相應(yīng)的枯草、酵母