一種熱凝膠多糖菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于菌株及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種熱凝膠多糖菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 熱凝膠多糖是一種由微生物產(chǎn)生的胞外多糖，由葡萄糖殘基通過β-1，3糖苷鍵 連接而成的葡聚糖，具有受熱形成凝膠的特性。熱凝膠多糖形成的膠不僅具有很強(qiáng)的熱穩(wěn) 定性，而且具有凍融穩(wěn)定性，能耐受多輪凍融處理仍保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，可作為食品固型劑、 增稠劑、可食性膜等，也可作為功能性物質(zhì)改善食品的粘彈性和適口性等品質(zhì)。作為一種安 全的多糖，熱凝膠多糖已被美國食品和藥品管理局（FDA)批準(zhǔn)可用作食品添加劑，在食品 工業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。熱凝膠多糖還具有重要的藥理性能，磺酸化的熱凝膠多糖具有 抗HIV病毒的活性，在制藥工業(yè)具有巨大的市場潛力。
[0003]目前熱凝膠多糖工業(yè)化生產(chǎn)在日本已獲得成功，我國相關(guān)生產(chǎn)和研究尚處于起步 階段。我國近些年雖在熱凝膠多糖產(chǎn)生菌種和發(fā)酵工藝方面取得了一些進(jìn)展，提高了熱凝 膠多糖的產(chǎn)量，但所生產(chǎn)的熱凝膠多糖凝膠強(qiáng)度仍較低，產(chǎn)品性能差，在市場上缺乏競爭 力。目前我國所需熱凝膠多糖主要從日本進(jìn)口。
[0004] 熱凝膠多糖產(chǎn)生菌種主要有土壤桿菌屬、根瘤菌屬和纖維單胞菌屬等屬的細(xì)菌， 產(chǎn)生菌種類較少。菌種產(chǎn)熱凝膠多糖的量和多糖的凝膠強(qiáng)度間無相關(guān)性。有的菌種熱凝膠 多糖產(chǎn)量高，但凝膠性差，凝膠強(qiáng)度低；有的菌種產(chǎn)熱凝膠多糖凝膠強(qiáng)度高，但產(chǎn)量低。目前 的研究注重通過菌種選育和工藝優(yōu)化提高產(chǎn)量，而很少結(jié)合凝膠特性進(jìn)行選育菌種和優(yōu)化 工藝，使得產(chǎn)品的性能不能滿足應(yīng)用需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種熱凝膠多糖菌株及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的 熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株高產(chǎn)、穩(wěn)定，所得熱凝膠多糖的凝膠強(qiáng)度高、口感好，可用于食品工業(yè)。
[0006] 本發(fā)明的一種熱凝膠多糖菌株，所述熱凝膠多糖菌株為土壤桿菌（Agrobacterium sp. )DH-2,保藏編號為CGMCCNo. 11546,核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 本發(fā)明的一種如權(quán)利要求1所述的熱凝膠多糖菌株的應(yīng)用，包括：
[0008] 將土壤桿菌（Agrobacteriumsp. )DH_2為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵， 得到發(fā)酵液，分離提純，干燥，得熱凝膠多糖；
[0009] 其中種子培養(yǎng)的條件為，在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為28-30 °C，搖床轉(zhuǎn)速 180-200rpm，培養(yǎng)時(shí)間16-20h;液體深層發(fā)酵的條件為：在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為 28°C-30°C，接種量 3% -10% (v/v)，搖床轉(zhuǎn)速 200-240rpm，培養(yǎng)時(shí)間 3d-5d。
[0010] 所述種子培養(yǎng)基的組分為：蔗糖 20g/L、（NH)2HP043g/L、KH2P04lg/L、MgS04· 7H20 0· 5g/L、酵母提取物lg/L、CaC033g/L，pH= 6. 8-7. 2。
[0011] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：碳源60g/L、（NH)2HP042. 3g/L、KH2P04lg/L、有機(jī)氮源 lg/L、MgS04. 7H20 0· 5g/L、CaC033g/L，pH= 6· 8-7. 2。
[0012] 所述碳源為葡萄糖和/或蔗糖；有機(jī)氮源為酵母提取物和/或玉米漿。
[0013] 所述分離提純具體為：將發(fā)酵液于4000-5000rpm離心3-5min，去除上清液，再加 水補(bǔ)充至原體積，然后按體積比1:1加入〇. 6MNaOH溶液，攪拌均勻，靜止放置0. 5-lh，然后 于9000-10000rpm離心5-10min，取上清液，加入0. 1-0. 3MHC1調(diào)pH值為中性；然后用80 目濾布進(jìn)行過濾，所得固形物中再加入1-2倍體積的水，再過濾，過濾得到的固形物中加入 2-3倍體積的95%乙醇，攪勻后于7000-9000rpm離心5-10min。
[0014] 所述干燥溫度為50-60 °C。
[0015] 所述熱凝膠多糖的純度為88-92% (w/w)，分子量為1. 8X106-2.OX106Da。
[0016] 2% (w/v)熱凝膠多糖95°C加熱lOmin的凝膠強(qiáng)度是680-860g/cm2。
[0017] 土壤桿菌的篩選方法是從土壤中采用平板菌落特征初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，經(jīng)測定 熱凝膠多糖產(chǎn)量和凝膠強(qiáng)度而得到。
[0018] 篩選平板培養(yǎng)基（g/L) :10g葡萄糖，5g酵母提取物，0. 05g苯胺藍(lán)，20g瓊脂， pH7. 2. 30°C培養(yǎng) 2 ~3d。
[0019] 挑選篩選平板上藍(lán)色的菌落，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)4d后，取發(fā)酵液 95°C加熱10分鐘，觀察能否形成凝膠。對能形成凝膠的發(fā)酵液提取其熱凝膠多糖。
[0020] 熱凝膠多糖產(chǎn)量的測定方法：取一定量發(fā)酵液于5000rpm離心5min，去除上清液， 再加水補(bǔ)充至原體積。然后按體積比1:1加入〇. 6MNaOH溶液，攪拌均勻，靜止放置lh。然 后于9000rpm離心lOmin，取上清液，加入0. 3MHC1調(diào)pH值為中性。然后用80目濾布進(jìn) 行過濾，所得固形物中再加入2倍體積的水，再過濾，過濾得到的固形物中加入3倍體積的 95%乙醇，攪勾后于9000rpm離心lOmin，取沉淀放入烘箱中60°C干燥。
[0021] 凝膠強(qiáng)度測定方法：取0. 3g樣品于15mL水中，用高速攪拌機(jī)使樣品在水中分散均 勾，制成懸浮液，將懸浮液轉(zhuǎn)移至18_X180mm的試管中，在真空狀態(tài)下抽氣3min，然后將 試管放入95°C水中加熱lOmin，取出后在冷水中冷卻30min。從試管中取出凝膠，取離底部 20mm和30mm處的一段10mm的凝膠，用質(zhì)構(gòu)儀進(jìn)行測定（探頭：P5,直徑0. 5cm不銹鋼活塞 式圓柱體。探頭移動(dòng)速度：250mm/min)。
[0022] 本發(fā)明的土壤桿菌（Agrobacteriumsp.)DH-2,已于2015年10月28日保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號為CGMCCNo. 11546。
[0023] 有益效果
[0024] 本發(fā)明提供了一株熱凝膠多糖高產(chǎn)菌，該菌種搖瓶發(fā)酵4d，熱凝膠多糖產(chǎn)量可達(dá) 29.58/1。熱凝聚多糖純度為88-92%(?/?)，分子量為1.8\10 6-2.0父1060&。95°(：加熱 10min，2% (w/v)熱凝膠多糖的凝膠強(qiáng)度為680~860g/cm2。本發(fā)明提供的熱凝膠多糖產(chǎn) 生菌株高產(chǎn)、穩(wěn)定，所得熱凝膠多糖的凝膠強(qiáng)度高、口感好，可用于食品工業(yè)。
【附圖說明】
[0025] 圖1熱凝膠多糖的4NMR圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 菌株的篩選
[0029] (1)稱取土樣10g放入三角瓶中，加入90mL無菌水和少量玻璃珠，搖床振蕩 lOmin，制成土壤懸池液。
[0030] (2)土壤懸濁液靜置lOmin后，取0.lmL加入到0. 9mL無菌生理鹽水中，經(jīng)系列梯 度稀釋至10 4、10 5、106三個(gè)梯度，分別取0.lmL涂篩選平板。
[0031] (3)將平板置于30°C培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2-3d后觀察。
[0032] (4)挑選菌落變藍(lán)且顏色較深的菌落在平板上劃線，取單菌落保藏。將平板上挑取 的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，培養(yǎng)條件為30°C、240rpm、4d。
[0033] (5)取發(fā)酵液于95°C水浴加熱lOmin，觀察能否形成凝膠。對能形成凝膠的發(fā)酵液 提取其凝膠多糖，測定熱凝膠多糖含量和凝膠強(qiáng)度。最終得到一株產(chǎn)量高、凝膠強(qiáng)度大、性 能穩(wěn)定的菌株DH-2。
[0034] 篩選平板培養(yǎng)基組成（g/L) :10g葡萄糖，5g酵母提取物，0.05g苯胺藍(lán)，20g瓊脂， pH7. 2.
[0035]發(fā)酵培養(yǎng)基組成（g/L):蔗糖 60、（NH)2HP042. 3、KH2P04l、MgS04. 7H20 0. 5、酵母提取 物l、CaC033、pH= 7. 0。
[0036] 實(shí)施例2
[0037] 分離菌株DH-2的鑒定
[0038] ⑴形態(tài)鑒定
[0039] 在LB平板培養(yǎng)ld，菌落灰白色，圓形凸起，Φlmm,表面光滑，邊緣整齊。顯微鏡下 菌體呈細(xì)桿狀，革蘭氏染色陰性。
[0040] ⑵生理生化鑒定
[0041] 菌株DH-2的生理生化特征見表1.
[0042] 表1菌株DH-2生理生化特征
[0043]
[0044] 其中，" + "表示呈陽性反應(yīng)，""表示呈陰性反應(yīng)。
[0045] ⑶16SrDNA序列鑒定
[0046] 提取菌株DH-2的總基因組DNA，并以此為模板，擴(kuò)增該菌株的16SrDNA 序列，其引物序列為SEQIDNo. 1，F(xiàn):5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，SEQIDΝο·2， R:5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'SEQIDNo. 3。將測得的 16SrDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn) 行相似性比對，發(fā)現(xiàn)DH-2菌株與土壤桿菌屬（Agrobacteriumsp.)的細(xì)菌最為接近。
[0047] 結(jié)合該菌株的形態(tài)、生理生化特征及16SrDNA序列，最終判定菌株DH-2應(yīng)屬于土 壤桿菌屬（Agrobacteriumsp.)的一種，命名為Agrobacteriumsp.DH-2。此菌株于 2015 年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC