菌種保藏號(hào)為CGMCCNo. 11547。
[0049] 實(shí)施例3
[0050] 從斜面上刮取一環(huán)菌種（根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6)，接種于裝有30ml種子培 養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C，180r/min，搖床培養(yǎng)20h，得到種子液。取種子液以8%的接 種量接入裝有l(wèi)〇〇ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30°C、240r/min搖床培養(yǎng)4d。
[0051] 種子培養(yǎng)基（g/L):蔗糖 20、（ΝΗ)2ΗΡ04 3、ΚΗ2Ρ04 1、MgS04· 7H20 0· 5、酵母提取物 l、CaC03 3、pH= 7· 0。
[0052] 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):蔗糖 60、（ΝΗ)2ΗΡ04 2· 3、KH2P04 1、MgS04. 7H20 0· 5、玉米漿 1、 CaC033、pH= 7. 0。
[0053] 取發(fā)酵液于5000rpm離心5min，除去上清液，再加水補(bǔ)充至原體積。然后按體積比 1 : 1加入0. 6MNaOH溶液，攪拌均勾，靜止放置1小時(shí)。然后于lOOOOrpm離心10min，取 上清液，加入0.3MHC1調(diào)至最終pH值為中性。然后用80目濾布進(jìn)行過(guò)濾，所得的固形物 中再加入2倍體積的水，再過(guò)濾，最后將過(guò)濾得到的固形物中加入3倍體積的95%乙醇，攪 勻后于9000rpm離心10min，取固形物放入烘箱中60°C干燥。熱凝膠多糖產(chǎn)量為23. 9g/L。
[0054]實(shí)施例4
[0055]從斜面上刮取一環(huán)菌種（根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6)，接種于裝有30ml種子培 養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C，200r/min，搖床培養(yǎng)16h，得到種子液。取種子液以5%的接 種量接入裝有l(wèi)〇〇ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于28°C、220r/min搖床培養(yǎng)5d。
[0056] 種子培養(yǎng)基（g/L):蔗糖 20、（ΝΗ)2ΗΡ04 3、ΚΗ2Ρ04 1、MgS04. 7H20 0· 5、酵母提取物 l、CaC03 3、pH= 7· 0。
[0057]發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖 60、（NH)2HP04 2. 3、KH2P04l、MgS04. 7H200.5、酵母提取 物l、CaC03 3、pH= 7· 0。
[0058] 取發(fā)酵液于5000rpm離心5min，除去上清液，再加水補(bǔ)充至原體積。然后按體積比 1 : 1加入0. 6MNaOH溶液，攪拌均勾，靜止放置1小時(shí)。然后于12000rpm離心5min，取上 清液，加入0.3MHC1調(diào)至最終pH值為中性。然后用80目濾布進(jìn)行過(guò)濾，所得的固形物中 再加入2倍體積的水，再過(guò)濾，最后將過(guò)濾得到的固形物中加入3倍體積的95%乙醇，攪勻 后于9000rpm離心5min，取固形物放入烘箱中60°C干燥。熱凝膠多糖產(chǎn)量為22. 2g/L。
[0059] 實(shí)施例5
[0060] 從斜面上刮取一環(huán)菌種（根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6)，接種于裝有30ml種子培 養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C，190r/min，搖床培養(yǎng)18h，得到種子液。取種子液以3%的接 種量接入裝有l(wèi)〇〇ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30°C、240r/min搖床培養(yǎng)3d。
[0061] 種子培養(yǎng)基（g/L):蔗糖 20、（ΝΗ)2ΗΡ04 3、ΚΗ2Ρ04 1、MgS04· 7H20 0· 5、酵母提取物 1、CaC03 3、pH= 7· 0。
[0062]發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖 60、（NH)2HP04 2. 3、KH2P04l、MgS04. 7H20 0. 5、酵母提取 物 0· 5、玉米漿 0· 5、CaC03 3、pH= 7· 0。
[0063] 取發(fā)酵液于5000rpm離心5min，除去上清液，再加水補(bǔ)充至原體積。然后按體積比 1 : 1加入0. 6MNaOH溶液，攪拌均勻，靜止放置1小時(shí)。然后于9000rpm離心lOmin，取上 清液，加入0.3MHC1調(diào)至最終pH值為中性。然后用80目濾布進(jìn)行過(guò)濾，所得的固形物中 再加入2倍體積的水，再過(guò)濾，最后將過(guò)濾得到的固形物中加入3倍體積的95%乙醇，攪勻 后于7000rpm離心10min，取固形物放入烘箱中60°C干燥。熱凝膠多糖產(chǎn)量為13. 2g/L。
[0064] 實(shí)施例6
[0065]從斜面上刮取一環(huán)菌種（根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6)，接種于裝有30ml種子培 養(yǎng)基的250ml三角瓶中，30°C，200r/min，搖床培養(yǎng)20h，得到種子液。取種子液以10%的接 種量接入裝有l(wèi)〇〇ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30°C、220r/min搖床培養(yǎng)4d。
[0066] 種子培養(yǎng)基（g/L):蔗糖 20、（ΝΗ)2ΗΡ04 3、ΚΗ2Ρ04 1、MgS04. 7H20 0· 5、酵母提取物 l、CaC03 3、pH= 7· 0。
[0067]發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖 30、蔗糖 30、（ΝΗ)2ΗΡ042. 3、KH2P04l、MgS04.7H200·5、 酵母提取物 1、CaC03 3、pH= 7. 0。
[0068] 取發(fā)酵液于5000rpm離心5min，除去上清液，再加水補(bǔ)充至原體積。然后按體積比 1 : 1加入0. 6MNaOH溶液，攪拌均勻，靜止放置1小時(shí)。然后于9000rpm離心10min，取上 清液，加入0.3MHC1調(diào)至最終pH值為中性。然后用80目濾布進(jìn)行過(guò)濾，所得的固形物中 再加入2倍體積的水，再過(guò)濾，最后將過(guò)濾得到的固形物中加入3倍體積的95%乙醇，攪勻 后于8000rpm離心10min，取固形物放入烘箱中60°C干燥。熱凝膠多糖產(chǎn)量為21. 6g/L。
[0069] 實(shí)施例7
[0070] 熱凝膠多糖的性質(zhì)
[0071] 用苯酚-硫酸法測(cè)定所得熱凝膠多糖的純度為88~92%，用烏式粘度計(jì)測(cè)定該 多糖的分子量為2. 25X106~2. 50X10 6Da。熱凝膠多糖的4NMR圖譜見(jiàn)圖1，表明該多糖 是由葡萄糖通過(guò)β-1，3糖苷鍵連接聚合而成。2% (w/v)熱凝膠多糖的凝膠強(qiáng)度為760~ 900g/cm2。6% (w/v)熱凝膠多糖形成的凝膠TPA分析見(jiàn)表2,與市售進(jìn)口商品相比，該菌株 產(chǎn)生的熱凝膠多糖形成的凝膠硬度上略低于市售樣品，彈性和內(nèi)聚性略高于市售樣品，兩 者的咀嚼性接近。
[0072] 表2 6 %凝膠的TPA分析
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株，其特征在于：所述菌株為根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6， 保藏編號(hào)為CGMCC No. 11547,核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。2. -種如權(quán)利要求1所述的熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，包括： 將根瘤菌（Rhizobiumsp. )DH-6經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，得到發(fā)酵液，然后分離提 純，干燥，制得熱凝膠多糖； 其中種子培養(yǎng)為：在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為28-30°C，搖床轉(zhuǎn)速180-200rpm，培養(yǎng) 時(shí)間16-2011;液體深層發(fā)酵為：在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，溫度為28°(：-30°(：，接種量3%-10% (v/v)，搖床轉(zhuǎn)速200-240rpm，培養(yǎng)時(shí)間3d-5d。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述種子培 養(yǎng)基為：蔗糖20g/L、（NH)2HP04 3g/L、KH2P04 lg/L、MgS04 · 7H20 0. 5g/L、酵母提取物lg/L、 CaC03 3g/L，pH = 6. 8-7. 2。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述發(fā)酵培 養(yǎng)基為：碳源60g/L、（NH)2HP04 2. 3g/L、KH2P04 lg/L、MgS04·7H20 0. 5g/L、有機(jī)氮源lg/L、 CaC03 3g/L，pH = 6. 8-7. 2。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述碳源為 葡萄糖或/和蔗糖。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述有機(jī)氮 源為酵母提取物和/或玉米漿。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述分離提 純具體為：取發(fā)酵液于4500-5000rpm離心3-5min，除去上清液，再加水補(bǔ)充至原體積，然后 按體積比1:1加入0. 6MNaOH溶液，攪拌均勻，靜止放置0. 5-lh，然后于9000-12000rpm離 心5-10min，取上清液，加入0.3MHC1調(diào)至最終pH值為中性，再用80目濾布進(jìn)行過(guò)濾，所得 的固形物中再加入1-2倍體積的水，再過(guò)濾，最后將過(guò)濾得到的固形物中加入2-3倍體積的 95%乙醇，攬勾后于7000-9000rpm離心5-lOmin。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述干燥溫 度為 50-60 °C。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述熱凝膠 多糖的分子量為 2. 25X106-2. 50X106Da，純度為 88-92% (w/w)。10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株的應(yīng)用，其特征在于：2% (w/v) 熱凝膠多糖95°C加熱10min的凝膠強(qiáng)度是760-900g/cm2。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株及其應(yīng)用，菌株為根瘤菌(Rhizobium？sp.)DH-6，保藏編號(hào)為CGMCC？No.11547，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。將根瘤菌(Rhizobium？sp.)DH-6經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵，制得熱凝膠多糖。本發(fā)明提供的熱凝膠多糖產(chǎn)生菌株具有所產(chǎn)凝膠多糖凝膠強(qiáng)度高、分子量大、高產(chǎn)等特性。CGMCC No.1154720151028
【IPC分類】C12P19/08, C12N1/20, C12R1/41
【公開(kāi)號(hào)】CN105420160
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510960634
【發(fā)明人】楊雪霞, 劉毅超, 付雅欣, 解秀娟, 魯偉, 步國(guó)建
【申請(qǐng)人】東華大學(xué), 泰興市東圣食品科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年3月23日
【申請(qǐng)日】2015年12月18日