一種造礁石珊瑚總rna提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種造礁石珊瑚總RNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 珊瑚礁是地球上的生物多樣性最高生態(tài)系統(tǒng)之一，珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)不僅為人類的 生產(chǎn)和生活提供各種生物資源，而且具有巨大的生態(tài)功能和生態(tài)價(jià)值，對保障生物多樣性、 生物生產(chǎn)力和生態(tài)平衡具有重要作用。然而近年來，世界范圍內(nèi)的珊瑚白化死亡現(xiàn)象日益 頻繁，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致珊瑚礁的退化。研究珊瑚白化機(jī)理不僅要了解珊瑚外在生理響應(yīng)，更要深 入認(rèn)識引起這些變化的內(nèi)在分子機(jī)制。造礁石珊瑚的種類繁多，有七十多屬。獲取高質(zhì)量 的造礁石珊瑚總RNA是進(jìn)行分子機(jī)制研究的首要條件。RNA的質(zhì)量好壞決定著可被反轉(zhuǎn)錄 為cDNA的最大序列信息，特別是對于體內(nèi)生活著大量微生物及蟲黃藻的復(fù)雜造礁石珊瑚 共生體。要獲得大量完整、純度高的總RNA，首先要清除珊瑚體內(nèi)的蟲黃藻、微生物等的影 響，其次要對造礁石珊瑚組織進(jìn)行充分完全地破碎，還要抑制RNA酶的降解作用，從而獲得 高質(zhì)量的總RNA。
[0003]目前常用的RNA提取方法多用于植物、動物組織的提取，并非適用于造礁石珊瑚， 且這些方法通常存在RNA得率和純度較低的問題，難以進(jìn)行下一步的分析。
[0004]目前，尚無造礁石珊瑚總RNA提取方法的專利及其他文獻(xiàn)資料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有適用于造礁石珊瑚的RNA提取方法的問 題，提供一種造礁石珊瑚總RNA提取方法；利用該方法提取的造礁石珊瑚RNA純度高、質(zhì)量 好，極大的減少了造礁石珊瑚RNA損耗和降低了DNA污染，能適用于后續(xù)RT-PCR等分子生 物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。
[0006] 本發(fā)明的造礁石珊瑚總RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和預(yù)處理、用裂 解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入異丙醇沉淀 RNA，棄上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚總RNA，其特征在于，
[0007] 所述的造礁石珊瑚的采集和預(yù)處理是用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其 表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；
[0008] 所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA是將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍 裂解液裂解釋放出RNA;所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分?jǐn)?shù)為38%的水飽和酚（酸性 水飽和酚，可以從試劑公司直接購買）、〇. 8M硫氰酸胍、0. 4M硫代氰酸氨、0. 1M乙酸鈉和體 積分?jǐn)?shù)為5%的甘油，其余為無RNA酶的水（RNase-free水）。
[0009] 所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其具體步驟為：
[0010] a、用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末， 得到造礁石珊瑚粉末；
[0011] b、將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍裂解液裂解，振蕩混合，室溫放置5min，4°C、 12000g離心5min，取上清液；所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分?jǐn)?shù)為38 %的酸性水 飽和酚、0. 8M硫氰酸胍、0. 4M硫代氰酸氨、0. 1M乙酸鈉和體積分?jǐn)?shù)為5 %的甘油，其余為 RNase-free水；
[0012] c、按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在步驟b的上清液中加入氯仿， 搖蕩混合，室溫放置5min，4°C、12000g離心15-20min;離心后溶液分3層，取出上層水相， 按取出的水相與異丙醇的體積比為2:1的量加入異丙醇，室溫沉淀lOmin后12000g離心 lOmin;棄上清，加入余下溶液等體積的無水乙醇，混勾，4°C、7500g離心5min;棄上清，干燥 5-10min，得到造礁石珊瑚總RNA，將該RNA溶于RNase-freewater中-70~_80°C保存。
[0013] 優(yōu)選，所述的造礁石珊瑚為鹿角杯形珊瑚、叢生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黃濱珊 瑚。
[0014] 優(yōu)選，所述的步驟a的無菌海水是經(jīng)高溫滅菌且經(jīng)0. 22μ微孔濾膜過濾的海水。 用無菌海水沖洗造礁石珊瑚體表，是為了去除珊瑚體表的其它附著的生物對造礁石珊瑚 RNA提取的影響。
[0015] 優(yōu)選，所述的步驟b的造礁石珊瑚粉末與異硫氰酸胍裂解液用量比為3g:lml;此 比例下提取效果最佳，造礁石珊瑚過少會導(dǎo)致RNA濃度過低；造礁石珊瑚過多會導(dǎo)致裂解 不完全，內(nèi)源性酶降解RNA嚴(yán)重。
[0016] 優(yōu)選，所述的步驟b和c的振蕩混合為劇烈振蕩15s。
[0017] 優(yōu)選，還包括以下步驟：在步驟c的按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在 步驟b的上清液中加入氯仿，搖蕩混合，室溫放置5min，4°C、12000g離心15-20min后，再重 復(fù)該操作2-3次；這樣處理后沉淀去除蛋白質(zhì)的效果更好。
[0018] 用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前優(yōu)選在低于_80°C環(huán)境下超低溫保存，更優(yōu)選 的，用干冰或液氮保存。這樣保存效果更好、時(shí)間更長，RNA不易降解。材料的新鮮程度與 RNA提取的質(zhì)量和得率有很大的關(guān)系，因此，在采樣時(shí)要保證材料能夠迅速超低溫凍存，采 樣時(shí)要盡可能帶上液氮或干冰以保存材料。
[0019] 本發(fā)明所用異硫氰酸胍裂解液對液氮研磨的粉末狀造礁石珊瑚組織具有較好的 裂解效果，能夠?qū)⒃旖甘汉鹘M織內(nèi)含物充分破碎，使細(xì)胞在裂解液中充分裂解，減少由于 研磨不充分造成RNA產(chǎn)量的損耗。
[0020] 利用本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)提取高質(zhì)量的造礁石珊瑚RNA，并最大限度的減少造礁 石珊瑚RNA量的損耗和降低DNA污染；提取的RNA經(jīng)RT-PCR后，可擴(kuò)增出目的基因條帶，且 條帶清晰可見，大小與預(yù)想一致，測序結(jié)果與GenBank收錄的序列相同，進(jìn)一步證實(shí)了用該 方法提取的RNA質(zhì)量和產(chǎn)量均達(dá)到了RT-PCR要求，可用于基因克隆、差異顯示分析、分子雜 交等各種分子生物學(xué)研究。
【附圖說明】
[0021] 圖1為造礁石珊瑚RNA電泳圖。
[0022] 圖2為造礁石珊瑚RNA反轉(zhuǎn)錄后得到的核糖體rRNA基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例1:
[0025] 2011年7月在三亞灣海域潛水采集鹿角杯形珊瑚、叢生盔形珊瑚和澄黃濱珊瑚樣 本，海水深度為l-5m，采樣時(shí)使用液氮保存樣品，以保證材料能夠迅速超低溫凍存。上述三 種造礁石珊瑚種類由中國科學(xué)院南海海洋研究所黃暉研究員鑒定。
[0026] 用經(jīng)高溫滅菌且經(jīng)0. 22μ微孔濾膜過濾的海水沖洗鹿角杯形珊瑚2-3次，以去除 鹿角杯形珊瑚體表的其它附著的生物；將研缽預(yù)冷，將鹿角杯形珊瑚表面的水吸干后，稱取 3g左右的鹿角杯形珊瑚組織，在盛有液氮的研缽中磨成粉末。將研磨破碎的鹿角杯形珊瑚 組織粉末轉(zhuǎn)移到干凈的EP管，然后加入lmL異硫氰酸胍裂解液，劇烈振蕩，室溫放置5min， 4°C、12000g離心5min，取上清液。按上清液與氯仿體積比為5:1的量在上清液中加入氯仿， 劇烈搖蕩15s，室溫放置5min，4°C、12000g離心15min。離心后溶液分3層，取上層水相轉(zhuǎn) 入新的EP管，按取出的水相與異丙醇的體積比為2:1的量加入異丙醇，室溫沉淀lOmin后 12000g離心lOmin。棄上清，根據(jù)EP管中余下溶液等體積加入無水乙醇，混勻，4°C、7500g 離心5min。棄上清，干燥5-10min，得到鹿角杯形珊瑚總RNA。將該RNA溶于RNase-free water，得到鹿角杯形珊瑚總RNA溶液，保存于-70°C。所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積 分?jǐn)?shù)為38 %的酸性水飽和酸、0. 8M硫氰酸胍、0. 4M硫代氰酸氨、0. 1M乙酸鈉和體積分?jǐn)?shù)為 5%的甘油，其余為RNase-free水。
[0027] 取1yL鹿角杯形珊瑚總RNA溶液在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液為 1XTAE，120V(電壓）25min，紫外燈下觀測和拍照，檢測所提取RNA樣品的質(zhì)量。鹿角杯形 珊瑚總RNA電泳結(jié)果如圖1所示，可以看出，瓊脂糖凝膠電泳板上鹿角杯形珊瑚總RNA譜帶 清晰，邊緣銳利，亮度較大，無降解，表明提取的RNA含量較高，并且28S條帶亮度約為18S 帶的兩倍，符合RNA分子完整、無明顯降解的標(biāo)準(zhǔn)，說明此方法能夠抑制鹿角杯形珊瑚細(xì)胞 內(nèi)多酚類物質(zhì)的氧化和多糖物質(zhì)對總RNA提取的影響。
[0028] 鹿角杯形珊瑚總RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT)反應(yīng)參照P:rime_Scripti>RTreagent Kit(Dalian,China)說明書進(jìn)行。由此得到鹿角杯形珊瑚cDNA。
[0029] 叢生盔形珊瑚和澄黃濱珊瑚的總RNA提取方法與本實(shí)施例中鹿角杯形珊瑚的總 RNA提取方法相同，經(jīng)電泳檢測，提取得到的RNA分子完整、無明顯降解。叢生盔形珊瑚和澄 黃濱珊瑚的RNA反轉(zhuǎn)錄方法也與本實(shí)施例中鹿角杯形珊瑚的反轉(zhuǎn)錄方法相同，由此得到叢 生盔形珊瑚cDNA和澄黃濱珊瑚cDNA。
[0030] 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的造礁石珊瑚（鹿角杯形珊瑚、叢生盔形珊瑚和澄黃濱珊 瑚）核糖體基因序列，用Primer5. 0設(shè)計(jì)引