黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的Indel標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種黃瓜柵欄狀表皮細(xì)胞基因 Pe的Indel標(biāo)記及其在黃瓜育種材料選擇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃瓜栽培廣泛，歷史悠久，類型和品種十分豐富，根據(jù)果實(shí)用途，可將黃瓜分為鮮 食黃瓜和加工黃瓜。加工黃瓜對(duì)原材料果實(shí)有特殊的要求，一般要求瓜條順直，皮色均勻， 肉質(zhì)較厚，皮質(zhì)緊密。黃瓜果實(shí)表皮細(xì)胞指黃瓜果實(shí)最外層的一層細(xì)胞，表皮細(xì)胞能減少果 實(shí)水分散失，保護(hù)果實(shí)免受物理傷害，位于表皮上的氣孔能調(diào)節(jié)果實(shí)與外界氣體的交換。不 同結(jié)構(gòu)形狀的表皮細(xì)胞對(duì)于果實(shí)所起的作用存在差異，柵欄狀的表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)能更好的保 護(hù)果實(shí)免受物理傷害，減少水分散失，同時(shí)使果實(shí)皮質(zhì)緊密，更適合于加工；扁平狀的表皮 細(xì)胞結(jié)構(gòu)在保護(hù)果實(shí)免受物理傷害、減少水分散失以及使皮質(zhì)緊密方面的效果相對(duì)較差。 [0003]目前，在黃瓜上與果實(shí)相關(guān)的性狀（比如，瓜長(zhǎng)、把長(zhǎng)、刺瘤、棱、紋等）研究較多， 而對(duì)于黃瓜果實(shí)表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究極少，僅見(jiàn)一篇報(bào)道。1987年，國(guó)外學(xué)者Fanourakis 以具有柵欄狀表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的加工型黃瓜和具有扁平狀表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的鮮食性黃瓜為材 料，進(jìn)行了果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的遺傳分析，結(jié)果表明，雜交后代h的果實(shí)表皮細(xì) 胞呈柵欄狀排列，匕群體出現(xiàn)了柵欄狀結(jié)構(gòu)和扁平狀結(jié)構(gòu)的分離，分離比符合柵欄狀：扁平 狀=3:1。結(jié)論認(rèn)為，黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)是由一個(gè)單基因（Pe)控制的，其中柵 欄狀對(duì)扁平狀為顯性，且該基因與果色一致基因u、果瘤基因Tu、無(wú)光澤基因D有連鎖關(guān)系。 截止目前，尚未見(jiàn)與Pe基因連鎖的分子標(biāo)記的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于本領(lǐng)域的上述空白，本發(fā)明的目的在于提供了一種與黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì) 胞基因Pe緊密連鎖的Indel標(biāo)記，并提供了該標(biāo)記在篩選果實(shí)具有柵欄狀結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞的 加工黃瓜種質(zhì)資源上的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種與黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe緊密連鎖的Indel標(biāo)記Indelpe02的引 物，其特征在于：具有如下核苷酸序列：
[0007] Indelpe02-F/Indelpe02-R：
[0008] TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG
[0009] 所述引物擴(kuò)增的與黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe連鎖的特征條帶為125bp，其 核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示；
[0010] 所述引物擴(kuò)增的與黃瓜果實(shí)扁平狀表皮細(xì)胞基因pe連鎖的特征條帶為130bp，其 核苷酸序列如SeqIDNo. 2所示。
[0011] 用于篩選包含果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的試劑盒，其特征在于，包 括所述的Indel標(biāo)記Indelpe02的引物。
[0012] 所述試劑盒還包括進(jìn)行PCR反應(yīng)和/或電泳所需的試劑。
[0013]用于篩選具有果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的方法，其特征在于，采用 所述的Indel標(biāo)記Indelpe02的引物和/或所述的試劑盒進(jìn)行如下步驟：
[0014] (1)采用所述Indel標(biāo)記Indelpe02的引物對(duì)待選黃瓜材料的基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；
[0015] (2)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；
[0016] (3)從檢測(cè)結(jié)果中篩選出現(xiàn)與黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe連鎖的Indel標(biāo)記 特征條帶一致的材料，所述與黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶 為125bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示。
[0017] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：1. 5ng/μ1DNA模板，所述引物正向和反向各5ng/ μ1，0.5μ1/μ1Go丨叫笈GreenMasterMix，其余為雙蒸水。
[0018] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒， 72°C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)；72°C保溫5分鐘，16°C保存。
[0019] 所述凝膠電泳檢測(cè)指，采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于150V恒功率電泳分 離，最后銀染顯色。
[0020] 所述試劑盒的制備方法，其特征在于，組裝試劑盒的試劑中包括所述的Indel標(biāo) 記Indelpe02的引物，或
[0021] 在標(biāo)有篩選含果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有所述 的Indel標(biāo)記Indelpe02的引物。
[0022] 組裝試劑盒的試劑中還包括PCR反應(yīng)和/或電泳所需的試劑，或
[0023] 在標(biāo)有篩選含果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有PCR 反應(yīng)和/或電泳所需的試劑。
[0024] 本發(fā)明提供一種與黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe緊密連鎖的Indel標(biāo)記 Indelpe02的引物，該引物的核苷酸序列如下：Indelpe02-F/Indelpe02_R:
[0025] TCTCCTCCTATACATTCTCA/GAAGATTATGAGGATGAGAG;所述引物擴(kuò)增的與黃瓜果實(shí)柵 欄狀表皮細(xì)胞基因Pe連鎖的特征條帶為125bp，其核苷酸序列如SeqIDNo. 1所示；所述 引物擴(kuò)增的與黃瓜果實(shí)扁平狀表皮細(xì)胞基因pe連鎖的特征條帶為130bp，其核苷酸序列如 SeqIDNo. 2所示。采用本發(fā)明所述的Indel標(biāo)記Indelpe02的引物對(duì)黃瓜材料進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，能較為準(zhǔn)確地測(cè)定待測(cè)材料中是否含有黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe，可被 有效地應(yīng)用于含有Pe基因的黃瓜材料的分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而省去了傳統(tǒng)的依靠 顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)的辨別步驟，大大地節(jié)省了獲得含有基因Pe的目標(biāo)材料的篩選時(shí)間， 提高了育種效率。
[0026] 基于上述Indel標(biāo)記Indelpe02的引物，本發(fā)明的一些實(shí)施例還提供了用于篩選 包含果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求所述的 Indel標(biāo)記Indelpe02的引物。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括進(jìn)行PCR反應(yīng)和/或電泳所需 的試劑。采用試劑盒的形式能進(jìn)一步完善本發(fā)明產(chǎn)品維度，提高本發(fā)明產(chǎn)品的便攜度，有利 于所述Indel標(biāo)記Indelpe02的引物的推廣應(yīng)用。
[0027] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了用于篩選具有果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基 因Pe的黃瓜材料的方法，所述方法指，采用所述的Indel標(biāo)記Indelpe02的引物和/或所 述的試劑盒進(jìn)行如下步驟：（1)采用所述Indel標(biāo)記Indelpe02的引物對(duì)待選黃瓜材料的 基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；（2)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)；（3)從檢測(cè)結(jié)果中篩選出現(xiàn) 與黃瓜果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶一致的材料，所述與黃瓜果 實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe連鎖的Indel標(biāo)記特征條帶為125bp，其核苷酸序列如SeqID No. 1所示。采用本發(fā)明所述的Indel標(biāo)記Indelpe02的引物和/或所述的試劑盒，通過(guò)上 述的步驟，能夠較為快速、便捷、準(zhǔn)確地獲知待測(cè)黃瓜材料中是否含有果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞 基因Pe，而無(wú)需再對(duì)黃瓜材料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，為育種工作節(jié)省了時(shí)間，提高了效率。
[0028] 具體地，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：1.5ng/ylDNA模板，所述引物正向和反向 各 5ng/μ1，0· 5μ1/μ1GoTaqS".GreenMasterMix，其余為雙蒸水。所述PCR擴(kuò)增的反 應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性15秒，55°C退火15秒，72°C延伸30秒，35個(gè)循環(huán)； 72°C保溫5分鐘，16°C保存。所述凝膠電泳檢測(cè)指，采用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，于 150V恒功率電泳分離，最后銀染顯色。上述試驗(yàn)參數(shù)是本發(fā)明根據(jù)引物的實(shí)際情況摸索調(diào) 試得出，在上述反應(yīng)條件下能夠使檢測(cè)結(jié)果以最優(yōu)的形式呈現(xiàn)，從而進(jìn)一步地提高本發(fā)明 選擇含有果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的準(zhǔn)確性。
[0029] 在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施例中，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)所述的試劑盒的制備方法，任 何基于商業(yè)目的的生產(chǎn)、制造和/或銷售所述試劑盒的行為均屬于本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的范 圍。所述行為指，組裝試劑盒的試劑中包括所述的Indel標(biāo)記Indelpe02的引物，或在標(biāo) 有篩選含果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有所述的Indel標(biāo)記 Indelpe02的引物。進(jìn)一步地，組裝試劑盒的試劑中還包括PCR反應(yīng)和/或電泳所需的試 劑，或在標(biāo)有篩選含果實(shí)柵欄狀表皮細(xì)胞基因Pe的黃瓜材料的用途的包裝內(nèi)裝有PCR反應(yīng) 和/或電泳所需的試劑。
[0030] 本發(fā)明以果實(shí)具有扁平狀結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞的黃瓜高代自交系WI2757與果實(shí)具有柵 欄狀結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞的黃瓜高代自交系Wis.SMR18為親本構(gòu)建FpF2、BCVVΒ(^Ρ2群體，在盛 瓜期采摘商品瓜，制作果實(shí)橫切面切片，在顯微鏡下觀察商品瓜表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)行遺傳分 析。以？ 2群體為作圖材料，利用BSA法和SSR及Indel標(biāo)記技術(shù)，實(shí)現(xiàn)Pe基因在染色體上的 遺傳定位，并獲得緊密連鎖的Indel標(biāo)記Indelpe02,與Pe的遺傳距離為3. 9cM。