一個(gè)水稻基因kt526在提高植物耐逆性能上的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物耐逆性相關(guān)的基因與其應(yīng)用，特別涉及來(lái)源于水稻的與抗逆相關(guān)的基因在提高植物耐冷性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻、玉米和小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，三大作物的產(chǎn)量、品質(zhì)對(duì)于我國(guó)的糧食生產(chǎn)和糧食安全都至關(guān)重要。干旱、鹽堿、高溫和凍害等非生物逆境會(huì)直接影響糧食作物的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量。利用現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)，如轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有耐逆性和廣泛適應(yīng)性的農(nóng)作物新品種，可以使農(nóng)作物在逆境條件下保持穩(wěn)定高產(chǎn)。隨著轉(zhuǎn)基因研究的深入，已經(jīng)陸續(xù)分離克隆了一些與抗逆相關(guān)的基因，包括代謝過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控基因、滲透調(diào)節(jié)蛋白、小分子物質(zhì)，還有參與調(diào)控各種逆境應(yīng)答途徑的轉(zhuǎn)錄因子等。
[0003]轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵基因，對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用。多年以來(lái)，轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能研究一直是科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，科學(xué)家們利用不同的研究路線分離鑒定了大量的轉(zhuǎn)錄因子，也從中發(fā)現(xiàn)了一些與農(nóng)藝性狀相關(guān)的調(diào)控因子，為農(nóng)作物的性狀改良提供了重要基因資源。在水稻基因組測(cè)序工作完成后，許多數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)水稻基因組進(jìn)行了分析。據(jù)預(yù)測(cè)，在秈稻和粳稻中分別包含2，025個(gè)和2，384個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，分屬于63個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，如WRKY (111/113，秈稻/粳稻)、bZIP (88/109)、AP2/EREBP (174/182),AUX/IAA (30/46)、MYB (136/138),HB (84/103)等。根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道與數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋，這里既包含植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，如WRKY，也包含與植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性等密切相關(guān)的其它一些轉(zhuǎn)錄因子家族，如bZIP、AP2/EREBP、MYB等。利用這些數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合基因芯片雜交、EST序列等基因表達(dá)信息，從基因組水平預(yù)測(cè)和分離水稻轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)cDNA，并利用已經(jīng)建立的高效的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)使其在水稻中過(guò)量表達(dá)，對(duì)其進(jìn)行規(guī)?；δ茯?yàn)證，進(jìn)一步通過(guò)研究轉(zhuǎn)基因水稻的表型變化及抗逆性能的改變等推斷轉(zhuǎn)錄因子的功能；在大量的重復(fù)性的植物轉(zhuǎn)化、表型分析、功能鑒定等工作的基礎(chǔ)上，尋找在改良農(nóng)作物中具有實(shí)用價(jià)值的植物重要調(diào)節(jié)因子，并應(yīng)用于作物的性狀改良，對(duì)有效解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際問(wèn)題，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一個(gè)與耐逆性相關(guān)的水稻基因KT526,以用于提高植物的耐逆性能。
[0005]本發(fā)明所提供的與耐逆性相關(guān)的KT52龜因，來(lái)源于稻屬水稻(Oryza sa ti vaL.)，編碼具有下述氣基酸序列的蛋白質(zhì):
1)序列表中的SEQ ID NO:1 ；
序列表中的SEQ ID NO:1由334個(gè)氨基酸殘基組成，為蛋白KT526。
[0006]本發(fā)明中尤/1 公袖勺編碼基因既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組DNA序列，或者是與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的編碼基因，可以具有序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0007]含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0008]擴(kuò)增^75^6任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。本發(fā)明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼本發(fā)明與耐逆性相關(guān)的基因?qū)胫参锝M織、細(xì)胞或器官，植物耐逆性獲得提高。
[0010]在上述提高植物耐逆性的方法中，本發(fā)明中水稻與耐逆性相關(guān)的因既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測(cè)試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0011]本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)^75^6基因或其同源序列可通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBin系列載體(如pBin 19等)、pBI系列載體(如pBI 101等)、Gateway?系列載體(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pENTER-TOPO、pUC系列載體或pBluescript系列載體等。
[0012]使用本發(fā)明中水稻與耐逆性相關(guān)的蓮因或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型(ΑΒΑ、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動(dòng)子。所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子，玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻actinl啟動(dòng)子等；所述組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子可為根特異性表達(dá)啟動(dòng)子、葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子、維管特異性表達(dá)啟動(dòng)子、種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng)子，如2S1啟動(dòng)子(GenBank號(hào):NM_118848.2，G1:30687489)和 NapinA (GenBank 號(hào):M64633.1，G1: 349405)啟動(dòng)子等;所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受低溫、干旱、ABA、乙烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子和/或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0013]為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。
[0014]其中，本發(fā)明以pCAMBIA1300為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的蓮因的植物表達(dá)載體命名為pCactF-KT526。攜帶有本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的^75^6基因或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用原生質(zhì)體-化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
[0015]此外，通過(guò)將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的#7^6基因或其同源序列的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對(duì)該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性進(jìn)一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)繁包括無(wú)性繁殖和/或種子繁殖。
[0016]本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官既可來(lái)源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹(shù)、桉樹(shù)、馬鈴薯或牧草等雙子葉植物，也可來(lái)源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。
[0017]本發(fā)明提供了一個(gè)與耐逆性相關(guān)的基因ΚΤ526。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可提高水稻對(duì)低溫耐受性。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C(jī)制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為表達(dá)載體pCactF的T-DNA區(qū)圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示CaMV35S基因的啟動(dòng)子；CaMV35S ter表示CaMV35S基因的終止子；pActl表示Actin基因的啟動(dòng)子；3flag表示3倍的flag標(biāo)簽序列；0CS表示0CS基因的終止子；HindII1、Kpnl、Spel、Xbal、Sail和PstI分別表示限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。
[0020]圖2為^75^5轉(zhuǎn)基因株系的耐冷性分析:A為冷處理前苗生長(zhǎng)狀態(tài)為冷處理5天苗生長(zhǎng)狀態(tài)；C為恢復(fù)培養(yǎng)一周后苗生長(zhǎng)狀態(tài)；D為冷處理后的苗存活率統(tǒng)計(jì)。
[0021]圖3為^75^5轉(zhuǎn)基因株系大田耐冷性分析:A為苗低溫生長(zhǎng)35天的狀態(tài)；B為苗低溫生長(zhǎng)49天的狀態(tài)；C為苗生長(zhǎng)35天時(shí)的株高統(tǒng)計(jì)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海英駿生物技術(shù)公司合成，測(cè)序由北京華大基因完成，PCR試劑盒、載體構(gòu)建過(guò)程中的核酸內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程有限公司，pEASY-ΤΙ連接試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自Promega公司，方法均參照試劑盒提供的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中所用的載體pCactF由本實(shí)驗(yàn)改造所得，基本骨架來(lái)自于CAMBIA公司的pCAMBIA1300。
[0023]KT52睡因的分離
從蓮因的編碼起始位點(diǎn)ATG開(kāi)始設(shè)計(jì)5’端引物，于終止密碼處設(shè)計(jì)3’端引物: 引物 1:5，tctagaATGTGTGGAGGCGCCATCCTC 3’
引物 2:5，ctgcagTCAGAAAAGGGCGCCGTCGATTG 3，
引物1中tctaga序列為限制性內(nèi)切酶Xbal的酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)識(shí)的序列為基因的編碼序列；引物2中ctgcag序列為限制性內(nèi)切酶PstI的酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)識(shí)的序列為蓮因的編碼序列。引物1的序列如SEQ ID No:3所示，引物2的序列如SEQ IDNo:4所示。
[0024]提取幼苗期的日本晴水稻的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA作為模板，用以上引物擴(kuò)增蓮因的全長(zhǎng)，其大小為1005bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，所編碼的蛋白