一種表面活性劑提高酵母細(xì)胞耐毒發(fā)酵性能的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物質(zhì)原料降解通過發(fā)酵工藝生產(chǎn)燃料乙醇領(lǐng)域，具體涉及一種表面 活性劑提高酵母細(xì)胞耐毒發(fā)酵性能的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著化石能源的日益枯竭和環(huán)境污染的日益加劇，可再生清潔能源生物乙醇的開 發(fā)和利用受到了人們的廣泛關(guān)注。木質(zhì)纖維素是自然界最為豐富且廉價的可再生資源，其 主要成分纖維素半纖維素是潛在的燃料乙醇的生產(chǎn)原料，利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇具 有重大的經(jīng)濟(jì)價值和社會意義。但是木質(zhì)纖維素材料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三者鏈 接緊密，對木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，打破三者之間的緊密結(jié)構(gòu)、去掉木質(zhì)素是生物乙醇 生產(chǎn)過程中必不可少的步驟。稀酸和蒸汽爆破預(yù)處理是目前研究較多的預(yù)處理方法，在 稀酸和蒸汽爆破預(yù)處理后的水解液不只包含可發(fā)酵糖，還存在弱酸、糠醛和5-羥甲基糠醛 (HMF)以及酚類化合物等，這些物質(zhì)對釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制作用，從而影響酵母菌的 正常生長和隨后的發(fā)酵過程。
[0003] 因此，對預(yù)處理的木質(zhì)纖維素水解液進(jìn)行脫毒處理顯得尤其重要。目前文獻(xiàn)報(bào) 道的脫毒方法主要包括水洗脫毒、物理脫毒（真空濃縮氣提法、膜分離法）、化學(xué)脫毒（是 石灰中和、活性炭吸附、離子交換、溶劑萃?。?、生物脫毒。例如文獻(xiàn)BioprocessBiosyst Eng(2013) 36:659 - 666采用活性炭吸附法討論了糠醛、HMF、乙酰丙酸等發(fā)酵抑制劑對酵母 細(xì)胞生長速度的影響；專利CA102226204B公開了一種木質(zhì)纖維素乙醇發(fā)酵液的脫毒方法， 通過在待處理糖液中添加可溶性電解質(zhì)鹽后加熱得到恒溫原料液通過膜組件進(jìn)行膜蒸餾 去除糖液中對后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)。可是，水洗、物理、化學(xué)脫毒等方式消耗大量 水資源、設(shè)備投資成本高且工藝復(fù)雜，而且脫毒效果差、糖分損失嚴(yán)重；YanlingYu報(bào)道了 一種生物脫毒法（BioresourceTechnology, 2011，102 (8) : 5123-5128)，通過利用構(gòu)巢曲霉 (FLZ10)對玉米秸桿蒸汽爆破液進(jìn)行生物脫毒處理，然后利用釀酒酵母進(jìn)行同步糖化發(fā)酵， 乙醇濃度達(dá)到34g/L，乙醇濃度未達(dá)工業(yè)生產(chǎn)的基準(zhǔn)濃度（5%體積比）。該方法需要增加 構(gòu)巢曲霉的設(shè)備投資、培養(yǎng)基化學(xué)試劑及能量消耗。因此，開發(fā)一種工藝簡單、成本低廉、效 果好的脫毒的方法是木質(zhì)纖維素乙醇工業(yè)的必經(jīng)之路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有的生物質(zhì)預(yù)處理過程中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)對后續(xù)發(fā)酵過 程的抑制作用，提供了一種表面活性劑提高酵母細(xì)胞耐毒發(fā)酵性能的方法。
[0005] -種表面活性劑提高酵母細(xì)胞耐毒發(fā)酵性能的方法，通過在發(fā)酵液中直接添加表 面活性劑作為細(xì)胞保護(hù)劑，在發(fā)酵過程中對發(fā)酵液進(jìn)行原位脫毒，以降低直至消除毒性物 質(zhì)對細(xì)胞生長的影響，提高發(fā)酵效率；具體按照以下步驟進(jìn)行：
[0006] 稱取釀酒酵母置于容器中，在33°C條件下用超純水復(fù)水活化15~30min后即可做 酒母使用；然后加入可發(fā)酵碳水化合物、表面活性劑、pH緩沖溶液、發(fā)酵抑制劑；封口，放入 搖床中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/min;進(jìn)行超高濃度乙醇發(fā)酵，發(fā)酵溫度為25~ 39°C，發(fā)酵時間1~130小時；
[0007] 在整個反應(yīng)體系中，所述釀酒酵母0.025-0. 25g，所述發(fā)酵碳水化合物的濃度為 60~400g/L、表面活性劑與緩沖液的質(zhì)量比為0-50%、發(fā)酵抑制劑的濃度為0~6g/L，溶 液的pH為3. 3~5. 5。
[0008] 所述的發(fā)酵介質(zhì)是包含木質(zhì)纖維素原料的預(yù)水解糖液或可發(fā)酵碳水化合物、釀酒 酵母、PH緩沖液。
[0009] 所述發(fā)酵抑制劑包括苯酚、愈創(chuàng)木酚、香蘭素中的一種或幾種的混合物，發(fā)酵抑制 劑濃度為0-6.Og/L。
[0010] 所述水溶性表面活性劑聚乙二醇、聚乙二醇單甲醚、聚乙二醇二甲醚、聚二甲基硅 氧烷、吐溫中的至少一種；優(yōu)選為聚乙二醇。
[0011] 所述pH緩沖溶液為：醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、磷酸-磷酸鈉緩沖液或硫 酸溶液。
[0012] 所述水溶性表面活性劑聚乙二醇的分子量為200-8000 ;優(yōu)選為200-2000。
[0013] 所述水溶性表面活性劑的添加量為緩沖液質(zhì)量的0% -40% ;優(yōu)選為25%。
[0014] 所述木質(zhì)纖維素原料的預(yù)水解液、可發(fā)酵碳水化合物為葡萄糖的濃度為60_400g/ L〇
[0015] 由于表面活性劑不僅蒸汽壓低、而且具有可調(diào)整的水溶性、通過對結(jié)構(gòu)及分子量 的選擇能夠?qū)崿F(xiàn)對其物理、化學(xué)、生物性質(zhì)的精細(xì)調(diào)控，對很多微生物都具有廣泛的生物相 容性。在含有毒性抑制物質(zhì)的發(fā)酵介質(zhì)中添加非離子表面活性劑可直接或間接的作為細(xì)胞 保護(hù)劑有效改善酵母細(xì)胞的生存能力，抑制毒性物質(zhì)對細(xì)胞的傷害，從而提高發(fā)酵性能。
[0016] 相對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中直接加入表面活性劑作為細(xì)胞保護(hù)劑進(jìn)行 同步脫毒發(fā)酵的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1)工藝簡單、操作方便。（2)操作時間短、設(shè)備投資 低、節(jié)約能源；（3)有效提高乙醇發(fā)酵效率、降低工業(yè)生產(chǎn)成本，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1不同濃度苯酚對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響；
[0018] 圖2不同濃度苯酚對乙醇濃度的影響；
[0019] 圖3 4g.L1苯酸在不同發(fā)酵時間對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響；
[0020] 圖4 4g.L1苯酚在不同發(fā)酵時間對乙醇濃度的影響；
[0021] 圖5不同濃度愈創(chuàng)木酚對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響；
[0022] 圖6不同濃度愈創(chuàng)木酚對乙醇濃度的影響；
[0023] 圖7 4g.L1愈創(chuàng)木酚在不同發(fā)酵時間對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響；
[0024] 圖8 4g.L1愈創(chuàng)木酚在不同發(fā)酵時間對乙醇濃度的影響；
[0025] 圖9不同濃度混合抑制劑對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響；
[0026] 圖10不同濃度混合抑制劑對乙醇濃度的影響；
[0027] 圖11 2g.L混合抑制劑對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響；
[0028] 圖12 2g.L混合抑制劑對乙醇濃度的影響；
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實(shí)施例 的限制，下述實(shí)施例和說明書中描述的內(nèi)容只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神 和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā) 明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
[0030] 另外，值得說明的是，以下各實(shí)施例中發(fā)酵液中各組分物的含量測定采用高效液 相色譜儀（Agilent1260)，依據(jù)葡萄糖投料量計(jì)算其轉(zhuǎn)化率、乙醇收率，依據(jù)發(fā)酵液中乙醇 質(zhì)量、活化水與pH液體積計(jì)算乙醇濃度：
[0034]色譜條件為：離子交換柱，柱溫為65°C，視差折光檢測器，檢測器為50°C;流動相： 5MmH2S04,流速 0. 6ml/min，進(jìn)樣量 25uL。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] 將0. 25g酵母粉在33°C條件下用2mL超純水復(fù)水15-30分鐘，然后加入3. 5g葡萄 糖、苯酚（〇_5g.L^、預(yù)先配置好的pH值為4. 3硫酸溶液6mL，放入搖床中進(jìn)行震蕩，在33°C 條件下發(fā)酵72小時。
[0037] 將0. 25g酵母粉在33°C條件下用2mL超純水復(fù)水15-30分鐘，然后加入3. 5g葡萄 糖、苯酚（〇_5g.L》、PEG-1000 (2. 0g)，預(yù)先配置好的pH值為4. 3硫酸溶液6mL，放入搖床中 進(jìn)行震蕩，在33°C條件下發(fā)酵72小時。
[0038] 葡萄糖轉(zhuǎn)化率、乙醇濃度分別如圖1、圖2所示。從圖中數(shù)據(jù)可以看出，向發(fā)酵體系 中加入苯酚對發(fā)酵效率有較強(qiáng)的抑制作用，而且隨著苯酚濃度的增加發(fā)酵效率逐漸下降； 而當(dāng)將PEG-1000加入含苯酚的發(fā)酵體系中，發(fā)酵效率有大幅提高。
[0039] 實(shí)施例2
[0040] 將0. 25g酵母粉在33°C條件下用2mL超純水復(fù)水15-30分鐘，然后加入3. 5g葡萄 糖、苯酚（4g.L^、預(yù)先配置好的pH值為4. 3硫酸溶液6mL，放入搖床中進(jìn)行震蕩，在33°C 條件下發(fā)酵8-100小時。
[0041] 將0. 25g酵母粉在33°C條件下用2mL超純水復(fù)水15-30分鐘，然后加入3. 5g葡萄 糖、苯酚（4. 0g.L^、PEG-400 (2. 0g)、預(yù)先配置好的pH值為4. 3硫酸溶液6mL，放入搖床中 進(jìn)行震蕩，在33°C條件下發(fā)酵8-100小時。
[0042] 葡萄糖轉(zhuǎn)化率、乙醇濃度分別如圖3、圖4所示。從圖中數(shù)據(jù)可以看出，向發(fā)酵體系 中加入苯酚（4. 0g.L3對發(fā)酵效率有較強(qiáng)的抑制作用；而當(dāng)將PEG-400加入含苯酚的發(fā)酵 體系中，發(fā)酵效率明顯大幅度提高。
[0043] 實(shí)施例3
[0044] 將0. 25g酵母粉在33°C條件下用2mL超純水復(fù)水15-30分鐘，然后加入3. 5g葡萄 糖、愈創(chuàng)木酚（〇_5g.L》、預(yù)先配置好的pH值為4. 3硫酸溶液6mL，放入搖床中進(jìn)行震蕩，在 33°C條件下發(fā)酵72小時。
[0045] 將0. 25g酵母粉在33°C條件下用2mL超純水復(fù)水15-30分鐘，然后加入3. 5g葡萄 糖、愈創(chuàng)木酚（〇_5g.L》、PEG-1000 (2. 0g)，預(yù)先配置好的pH值為4. 3硫酸溶液6mL，放入搖 床中進(jìn)行震蕩，在33°C條件下發(fā)酵72小時。
[0046] 葡萄糖轉(zhuǎn)化率、乙醇濃度分別如圖5、圖6所示。從圖中數(shù)據(jù)可以看出，向發(fā)酵體系 中加入愈創(chuàng)木酚對發(fā)酵效率有較強(qiáng)的抑制作用，而且隨著苯酚濃度的增加發(fā)酵效率逐漸下 降；而當(dāng)將PEG-1000加入含苯酚的發(fā)酵體系中，發(fā)酵效率有大幅提高。
[0047] 實(shí)施例4
[0048] 將0. 25g酵母粉在33°C條件下用2mL超純水復(fù)水15-30分鐘，然后加入3. 5g葡 萄糖、愈創(chuàng)木酚（5g.L》、預(yù)先配置好的pH值為4. 3硫酸溶液6mL，放入