用于生產(chǎn)酶的方法
【專利說明】用于生產(chǎn)酶的方法
[0001] 本申請是發(fā)明名稱為"用于生產(chǎn)酶的方法"、申請日為2011年12月19日的中國專 利申請201180066059. 5的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)酶的方法。具體而言，本發(fā)明涉及用于單細(xì)胞油過程中生產(chǎn) 酶的過程和所述酶在相同或其他過程中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 某些微生物能夠在合適的生理條件下積累胞內(nèi)三酰甘油，單細(xì)胞油。已經(jīng)利用該 特性主要生產(chǎn)專門用途和高價值產(chǎn)品如化妝品和營養(yǎng)應(yīng)用的單細(xì)胞油。迄今，已經(jīng)通過其 中生產(chǎn)的工藝經(jīng)濟性和適用性并不占優(yōu)明顯地位的小規(guī)模或中等規(guī)模生產(chǎn)過程滿足用于 這些目的的單細(xì)胞油的需求。
[0004] 目前，對于使用非化石原料作為運輸用燃料前體的化石原料的替代物，存在日益 增加的興趣。主要挑戰(zhàn)似乎是單細(xì)胞油的生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)以如此龐大的規(guī)模進(jìn)行，從而不可避免 對于加工大規(guī)模含水微生物常見的問題。在特征上，單細(xì)胞油生產(chǎn)過程需要高能量輸入并 產(chǎn)生大量的含水側(cè)流和單細(xì)胞碎片。因此，用于超大規(guī)模含水微生物加工的目前技術(shù)似乎 不是經(jīng)濟可行的并且涉及幾個有關(guān)環(huán)境的問題。
[0005] 碳水化合物是地球上儲量最豐富的生物質(zhì)并且因此大規(guī)模生產(chǎn)單細(xì)胞油的唯一 現(xiàn)實底物。木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的碳水化合物來源。然而，木質(zhì)纖維素生物材料或 其他復(fù)合生物材料需要充分加工以使它們由微生物可用作養(yǎng)分和用作單細(xì)胞油的來源。伴 隨木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的加工，同時將出現(xiàn)不可發(fā)酵的側(cè)流（sidestream)，如木質(zhì)素。在另 一方面，單細(xì)胞油生產(chǎn)過程本身產(chǎn)生仍含有相當(dāng)量養(yǎng)分的細(xì)胞物質(zhì)和側(cè)流。
[0006] 已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)的一些出版物中提出再利用各種發(fā)酵過程的側(cè)流和總體過程經(jīng) 濟性的改善。單細(xì)胞油生產(chǎn)的數(shù)量上占優(yōu)勢的側(cè)流是發(fā)酵廢水和從細(xì)胞取出油后剩余的細(xì) 胞碎片。US2009/0064567A1公開了通過培育原生藻菌（Stramenopile)界微生物借助異養(yǎng) 發(fā)酵生產(chǎn)生物油。此公開提出使脫脂生物質(zhì)或水解的生物質(zhì)再循環(huán)至用于培養(yǎng)微生物的培 養(yǎng)基。
[0007] 發(fā)明簡述
[0008] 本發(fā)明的一個目的是為現(xiàn)有技術(shù)中遇到的問題提供解決方案。具體而言，本發(fā)明 旨在為大規(guī)模生產(chǎn)單細(xì)胞油中遇到的問題提供技術(shù)上有益的解決方案。
[0009] 具體而言，本發(fā)明的一個目的是提供解決方案，所述解決方案使提高大規(guī)模單細(xì) 胞油生產(chǎn)的經(jīng)濟性成為可能。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供解決方案，所述解決方案使減低大規(guī)模單細(xì)胞油生產(chǎn) 造成的環(huán)境負(fù)擔(dān)成為可能。
[0011] 本發(fā)明特別旨在解決與制造交通用生物燃料相關(guān)的問題。
[0012] 為實現(xiàn)這些目的，本發(fā)明特征在于獨立權(quán)利要求所列的特征。其他權(quán)利要求代表 本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
[0013] 本發(fā)明方法基于以下發(fā)現(xiàn)：單細(xì)胞油生產(chǎn)過程的側(cè)流包含顯著量的養(yǎng)分，所述養(yǎng) 分可以充當(dāng)微生物（例如產(chǎn)油微生物）的碳源。
[0014] 現(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)在單細(xì)胞油生產(chǎn)過程的側(cè)流還包含顯著量的蛋白質(zhì)，尤 其酶。因此，所述微生物培養(yǎng)物或其級分可以用作酶的來源或用作酶制備物或用作酶制備 物的組分。
[0015] 在一個方面，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)酶的過程，所述過程包括在適于單細(xì)胞油產(chǎn)生 和適于酶產(chǎn)生的條件下培育能夠同時產(chǎn)生單細(xì)胞油（脂質(zhì)）和酶的微生物，并且所述單細(xì) 胞油（脂質(zhì)）和酶由所述微生物產(chǎn)生。
[0016] 在本發(fā)明的一個實施方案中，回收包含微生物細(xì)胞和使用過的培養(yǎng)基的微生物培 養(yǎng)物。
[0017] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，講上清液和/或微生物細(xì)胞與微生物培養(yǎng)物分離 并且回收所述上清液和/或細(xì)胞。
[0018] 此外，在本發(fā)明的另一個實施方案中，在微生物培養(yǎng)物中或在上清液中富集蛋白 質(zhì)級分并且回收富集的蛋白質(zhì)級分。這可以通過例如濃縮微生物培養(yǎng)物的水相（培養(yǎng)液） 或上清液實現(xiàn)。
[0019] 此外，在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過自溶或誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解從細(xì)胞回收由 微生物產(chǎn)生的胞內(nèi)酶?？梢詮纳锨逡菏斋@從細(xì)胞釋放的酶。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，酶從上清液回收。分泌至培養(yǎng)基或因細(xì)胞溶解 所釋放的酶是細(xì)胞外的并且可以從上清液回收。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的又一個實施方案，培養(yǎng)基是固態(tài)或半固態(tài)的并且將酶在回收之前導(dǎo) 入水相。
[0022] 在本發(fā)明的多種實施方案中，從微生物培養(yǎng)物或其級分以催化活性形式回收酶。
[0023] 在本發(fā)明的一個實施方案中，將包含催化活性酶的微生物培養(yǎng)物或液相導(dǎo)入相同 的生物技術(shù)過程中，或用所述酶預(yù)處理所述過程中使用的原料，如聚合物生物質(zhì)。
[0024] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，將包含催化活性酶的微生物培養(yǎng)物或液相導(dǎo)入另 一個過程中，或?qū)⑺鲞^程中使用的原料（如聚合物生物質(zhì)）預(yù)處理。
[0025] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，將包含微生物產(chǎn)生的酶的微生物培養(yǎng)物或液相導(dǎo) 入使用不能產(chǎn)生酶的微生物的生物技術(shù)過程中，或?qū)⑺鲞^程中使用的原料（如聚合物生 物質(zhì)）預(yù)處理。
[0026] 相同的或另一個過程優(yōu)選地是單細(xì)胞油生產(chǎn)過程。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，該過程是使用聚合物生物質(zhì)和/或聚合物糖（如木 質(zhì)纖維素）作為原料的過程。
[0028] 在另一個實施方案中，將微生物培養(yǎng)物或上清液的富含蛋白質(zhì)級分導(dǎo)入另一個工 業(yè)過程中或?qū)⑺脕硖幚砉┙o至另一個工業(yè)過程的原料。
[0029] 在另一個實施方案中，將微生物培養(yǎng)物或上清液的富含蛋白質(zhì)級分導(dǎo)入另一個生 物技術(shù)過程中或?qū)⑺脕硖幚砉┙o至其他生物技術(shù)過程的原料，如聚合物生物質(zhì)和/或聚 合物糖。
[0030] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，將所述微生物培養(yǎng)物中或所述上清液中的蛋白質(zhì) 級分富集、回收并任選地純化、穩(wěn)定、干燥和/或配制并且在各種應(yīng)用中用作酶制備物或用 作酶的來源。
[0031 ] 在本發(fā)明的又一個實施方案中，酶是胞內(nèi)的并且從細(xì)胞獲得。將胞內(nèi)酶回收并任 選地富集、純化、分離、穩(wěn)定、干燥和/或配制。
[0032] 生產(chǎn)單細(xì)胞油和酶的主要優(yōu)點是在大規(guī)模單細(xì)胞油生產(chǎn)的背景下考慮單細(xì)胞油 生產(chǎn)的成本效率和與工藝側(cè)流相關(guān)的環(huán)境事項。另外，集成方法導(dǎo)致更高效地利用聚合物 生物質(zhì)，同時減少含水發(fā)酵過程常見的側(cè)流的生物需氧量。
[0033] 本發(fā)明提供幾項經(jīng)濟及環(huán)境優(yōu)點：
[0034] -處理木質(zhì)纖維素材料或包含其他聚合物糖生物質(zhì)的材料的能量成本因使用本身 來自單細(xì)胞油過程的酶替代商業(yè)酶處理和熱機械和化學(xué)處理而降低。
[0035] -從單細(xì)胞油生產(chǎn)發(fā)酵過程的液體剩余物中取出酶蛋白減少了從單細(xì)胞油生產(chǎn)過 程釋放的發(fā)酵液的生物耗氧負(fù)荷。
[0036] -在取出細(xì)胞物質(zhì)后，基本上無細(xì)胞的發(fā)酵廢液更適合再利用。
[0037] -從發(fā)酵廢水中減少或取出酶蛋白（而不是在工藝流中造成生物負(fù)荷）、將它們?yōu)?催化目的再利用并且作為單細(xì)胞油生產(chǎn)過程或其他工業(yè)過程或尤其生物技術(shù)過程中的養(yǎng) 分使用時，改善單細(xì)胞油過程的碳平衡。
[0038] -從發(fā)酵液回收的酶可以用于水解微生物或微生物組分的聚合物化合物。
[0039] -可以通過使用已知并驗證過的單元操作和工業(yè)適用微生物物種實施本發(fā)明的方 法。
[0040] -本發(fā)明有助于木質(zhì)纖維素材料用于生產(chǎn)單細(xì)胞油的經(jīng)濟和技術(shù)可用性。
[0041] 附圖簡述
[0042] 圖1工藝方案
[0043] 圖2是每體積培養(yǎng)液在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木 聚糖。
[0044] 圖3是每蛋白質(zhì)在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木聚糖。
[0045] 圖4是每體積培養(yǎng)液在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木 聚糖。
[0046] 圖5是每蛋白質(zhì)在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木聚糖。
[0047] 圖6是每體積培養(yǎng)液在水解試驗中所釋放的葡萄糖。作為底物，使用lg纖維素。
[0048] 圖7是每蛋白質(zhì)在水解試驗中所釋放的葡萄糖。作為底物，使用lg纖維素。
[0049] 圖8是每體積培養(yǎng)液在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木 聚糖。
[0050] 圖9是每蛋白質(zhì)在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木聚糖。
[0051] 圖10是每體積培養(yǎng)液在水解試驗中所釋放的葡萄糖。作為底物，使用lg纖維素。 一些木糖從半纖維素釋放，所述半纖維素源自所用的培養(yǎng)液。
[0052] 圖11是每蛋白質(zhì)在水解試驗中所釋放的葡萄糖。作為底物，使用lg纖維素。一 些木糖從半纖維素釋放，所述半纖維素源自所用的培養(yǎng)液。
[0053] 圖12是每體積培養(yǎng)液在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木 聚糖。
[0054] 圖13是每蛋白質(zhì)在水解試驗中所釋放的木糖。作為底物，使用200mg樺木木聚糖。
[0055]圖14是每體積培養(yǎng)液在水解試驗中所釋放的葡萄糖。作為底物，使用lg纖維素。 一些木糖從半纖維素釋放，所述半纖維素源自所用的培養(yǎng)液。
[0056]圖15是每蛋白質(zhì)在水解試驗中所釋放的葡萄糖。作為底物，使用lg纖維素。一 些木糖從半纖維素釋放，所述半纖維素源自所用的培養(yǎng)液。
[0057] 發(fā)明描述
[0058] "單細(xì)胞油生產(chǎn)過程"在本文中指一種過程，其包括以下步驟：形成脂質(zhì)合成微生 物或允許其形成并允許如此獲得的生物物質(zhì)產(chǎn)生和/或貯存（積累）脂質(zhì)，從液相回收細(xì) 胞，和從細(xì)胞提取或回收脂質(zhì)。如本文稍后所述，在各種微生物群體中（如多種細(xì)菌、古細(xì) 菌、真菌（絲狀真菌）、酵母和藻類中）為產(chǎn)生單細(xì)胞油的微生物。
[0059] 如本文所述，本發(fā)明優(yōu)選地使用能夠同時產(chǎn)生脂質(zhì)和酶的微生物。在本發(fā)明的一 些實施方案中，"微生物"指兩種或更多種微生物。在一些實施方案中，酶由一種微生物產(chǎn)生 而單細(xì)胞油（脂質(zhì)）由另一種微生物產(chǎn)生。
[0060] 術(shù)語"單細(xì)胞油"指脂肪性物質(zhì)，其分子通常含有脂族烴鏈作為部分，其溶解于非 極性有機溶劑中但是在水中溶解不良。脂質(zhì)是活細(xì)胞中重要的一組大分子。單細(xì)胞油例如 是脂質(zhì)、脂肪、蠟、蠟酯、固醇、類萜、類異戊二烯、類胡蘿卜素、聚羥基鏈烷酸酯、核酸、脂肪 酸、脂肪醇、脂肪醛、脂肪酸酯、磷脂、糖脂、鞘脂和?；视腿缛８视?、二酰甘油或單酰甘 油。
[0061] 本發(fā)明中，優(yōu)選的單細(xì)胞油是脂質(zhì)、脂肪、蠟、?；视秃椭舅岷退鼈兊难苌?， 尤其三酰甘油和蠟酯。
[0062] 與本發(fā)明相關(guān)，"脂質(zhì)"作為單細(xì)胞油的同義詞使用。
[0063] 在一個方面，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)酶的方法，所述方法包括在單細(xì)胞油生產(chǎn) 過程中在適于單細(xì)胞油產(chǎn)生和酶產(chǎn)生的條件下培育能夠同時產(chǎn)生脂質(zhì)和酶的微生物。允許 所述微生物產(chǎn)生脂質(zhì)和酶。單細(xì)胞油（脂質(zhì)）從微生物細(xì)胞和微生物培養(yǎng)物和/或培養(yǎng)基 或其部分回收，或使用微生物培養(yǎng)物和/或培養(yǎng)基的各種級分作為酶制備物或作為酶的來 源。
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