一種志賀氏菌的核酸恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種針對志賀氏菌核酸的恒溫擴增快速檢測技術，適合對志賀氏菌的 定性檢測。 (二）
【背景技術】
[0002] 志賀氏菌（Shigella)是重要的腸道傳染病的病原菌之一，為無動力、無芽胞的革 蘭陰性桿菌，具有腸桿菌科細菌的基本特性。據(jù)國內(nèi)綜合資料，志賀氏菌在我國感染性腹 瀉病原菌中居首位。全世界每年有16470萬例志賀氏菌感染病例，有110萬人因此而死亡。 志賀氏菌引起的細菌性痢疾常發(fā)現(xiàn)于人員大量集中的地方，如餐廳和食堂。與其相關的食 品包括色拉、生蔬菜、奶和奶制品、肉禽、水果和面包制品等。因此，對志賀氏菌的快速檢測 具有重要的意義。
[0003] 目前檢測志賀氏菌的方法主要有傳統(tǒng)分離培養(yǎng)、免疫學和分子水平的檢測。在分 子水平方面，傳統(tǒng)PCR技術以高敏感性和特異性被廣泛應用，但因其對設備要求較高，在基 層應用方面較難普及。近年來，環(huán)介導等溫擴增（LAMP)技術的發(fā)明為病原菌的檢測提供 了新的思路和研究方向。本發(fā)明研制了恒溫擴增志賀菌核酸，并結合核酸試紙條顯色來判 定檢測結果的方法，且整個反應過程不打開反應管蓋子，試紙條流動檢測過程密閉，杜絕了 核酸擴增產(chǎn)物污染外界的可能性。研究表明該志賀氏菌恒溫擴增-核酸試紙條檢測方法具 有特異性強、敏感度高、對儀器要求簡單、檢測時間短等優(yōu)點，因此非常適用在基層檢驗機 構使用，同時在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的現(xiàn)場檢測與臨床上的床邊診斷上也具有很好的應用前 景。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種準確、靈敏、快速地檢測志賀氏菌核酸的恒溫擴增檢測試 劑盒及其檢測方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種志賀氏菌的恒溫擴增檢測試劑盒，所述試劑盒包括如下組成：
[0007] (1)DNA提取試劑（優(yōu)選Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(貨號DV810A);
[0008] (2)恒溫擴增反應液，包括：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴 增引物、lXThermolbuffer、MgS04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和無菌雙蒸水；其中：
[0009] 所述的外圍引物分別為：
[0010] 所述正向外圍引物為：5' -GGCAGGGAAATGTTCCGC-3'(SEQIDN0. 2);
[0011] 反向外圍引物為：5' -GCTTCTGACCATGGCTTCG-3'(SEQIDNO. 3);
[0012] 所述兩條探針的序列分別為：
[0013] 正向 5'端Biotin標記探針：5' -Biotin-
[0014] CCACAAAATGGAGAGTTCTGACTTT-3r(SEQIDNO. 4)；
[0015]反向 5' 端FitC標記探針：5' -Fitc-TCCACTGCCGTGAAGGAA-3'(SEQIDNO. 5);
[0016] 所述兩條擴增交叉引物分別為：
[0017] 擴增正向引物：
[0018] 5，-GGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTGGAGGACATTGCCCG-3,
[0019](SEQIDNO. 6)；
[0020] 擴增反向引物：
[0021] 5r -TGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTTTGCTGTCACTCCCGACA-3r
[0022] (SEQIDNO. 7)；
[0023] (3)陽性對照：含有志賀氏菌ipaH基因片段的DNA質(zhì)粒；
[0024] ⑷陰性對照：無菌雙蒸水。
[0025]進一步，本發(fā)明所述的 1XThermolbuffer組成為：20mM的Tris-HCl、10mM的 KCl、10mM的（NH4)2S04、2mM的MgS04&及質(zhì)量濃度為 0.1% 的TritonX-100，pH7.5。
[0026] 進一步，本發(fā)明所述陽性對照為含有長216bp的志賀氏菌ipaH基因序列的片段， 所述片段的核苷酸序列如下（SEQIDNO. 1):
[0028] 進一步，本發(fā)明所述陽性對照按如下步驟制備：
[0029] 以包含擴增區(qū)域的志賀氏菌ipaH基因片段為模板，通過兩條外圍引物進行PCR擴 增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒（Promega)對PCR擴增產(chǎn)物進行純化；將純化后的擴 增產(chǎn)物通過T-easy質(zhì)粒轉染試劑盒（Promega)構建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列，用分 光光度計對所抽提的質(zhì)粒測A2S。定量并稀釋至1個拷貝/μ1，獲得陽性對照，-20°C保存。
[0030] 進一步，本發(fā)明所述恒溫擴增反應液組成為：兩條外圍引物各lOpmol，兩條探針 各 20pmol，兩條交叉引物各 40pmol，IXThermolbuffer，MgS04S6mmol，dNTPs溶液各 0. 4mmol，BstDNA聚合酶8U，無菌雙蒸水組成補足至25μ1。
[0031] 本發(fā)明還提供一種所述志賀氏菌的核酸恒溫擴增檢測試劑盒的檢測方法，所述檢 測方法為：
[0032]a)用DNA提取試劑從待檢測的標本中提取DNA;
[0033] b)將步驟a)提取得到的DNA作為模板加入到裝有恒溫擴增反應液的PCR管中，在 65°C下擴增反應35分鐘；標準陽性模板（即陽性對照）加入陽性對照PCR管中，標準陰性 模板（即陰性對照）加入陰性對照PCR管中，所述標準陽性模板為含有志賀氏菌ipaH基因 片段的質(zhì)粒，所述標準陰性模板為無菌雙蒸水；
[0034] c)將反應后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測裝置（杭州優(yōu)思達生物技術公 司3號裝置）中進行檢測，2分鐘以后判讀結果，當試紙條的檢測線呈陽性時（C、T線均為 紅色），說明樣品中含有志賀氏菌核酸。該試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序有樣品 墊、有色顆粒結合物墊和吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設有檢測線 和質(zhì)控線，其中有色顆粒結合物墊上的有色顆粒有抗FitC抗體包被，檢測線上有親和素包 被，質(zhì)控線上有抗FitC抗體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0035] 在本發(fā)明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測探針。本試 劑盒中的6條寡聚核苷酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA合成不斷的自我擴增循環(huán)。在本發(fā)明提供的志賀氏菌核酸的恒溫擴增檢測試劑盒中，對不 同的反應條件進行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mg2+濃度，反應溫度等的優(yōu)化，并將本發(fā)明 與核酸檢測試紙條檢測系統(tǒng)相結合，建立了志賀氏菌核酸恒溫擴增定性檢測的方法。該試 劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出10個拷貝，可以滿足快速檢測志賀氏菌核酸的要 求。
[0036] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)點和效果：
[0037] (1)本發(fā)明所述志賀氏菌的核酸恒溫擴增檢測試劑盒的特異性好，靈敏度高，步驟 簡單，可重復性高；
[0038] (2)反應速度快，單個樣本從樣本處理到完成檢測，僅需1小時左右；
[0039] (3)整個擴增和檢測過程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴增產(chǎn)物污染的機會；整 個反應過程不需要復雜的儀器。 (四）
【附圖說明】
[0040] 圖1為核酸檢測試紙條原理示意圖。
[0041] 圖2為特異性實驗結果，圖中1-16分別表示鮑氏志賀氏菌ATCC8704、宋氏志賀氏 菌CMCC51592、痢疾志賀氏菌CMCC51105、福氏志賀氏菌CMCC51572、銅綠假單胞桿菌（綠 膿桿菌）ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922、陰溝腸桿 菌ATCC13047、副溶血性弧菌ATCC17802、空腸彎曲菌ATCC33291、單增李斯特氏菌ATCC 19111、傷寒沙門氏菌CMCC50071、鼠傷寒沙門氏菌CMCC50115、艱難梭菌ATCC9689、陽性 對照品、陰性對照品的實驗結果
[0042] 圖3為敏感性實驗，圖中1-6分別表示104拷貝/微升、10 3拷貝/微升、10 2拷貝/ 微升、101拷貝/微升、10 °拷貝/微升、陰性對照品的實驗結果 (五）
【具體實施方式】
[0043] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0044] 實施例1本發(fā)明試劑盒的組成與配制
[0045]a) DNA提取試劑（優(yōu)選Takara公司的Bacterial Genomic DNA Extraction Kit(貨號DV810A);
[0046]b)志賀氏菌的核酸恒溫擴增反應液：兩條外圍引物（lOpmol)，兩條探針（20pmol) 和兩條交叉引物（40pmol)，1XThermolbuffer，MgS04 (6mmol)，dNTPs溶液（各 0· 4mmo1)， BstDNA聚合酶（8U)和無菌雙蒸水組成，總反應液體積為25μ1;
[0047]正向外圍引物為：5，-GGCAGGGAAATGTTCCGC-3'