二聚探針同時檢測櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及二聚探針同時檢測櫻桃綠環(huán)斑駁病毒和 桃潛隱花葉類病毒的斑點雜交試劑盒及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 桃潛隱花葉類病毒（Peachlatentmosaicviroid，PLMVd)屬于Avsunviroidae 科，主要侵染桃樹、李、杏等核果類果樹。1997年，Hadidi等報道PLMVd在歐洲、亞洲、 北美和南美的桃種質(zhì)中廣泛分布（約為55 % ) (Hadidi,A,Giunchedi,L,Shamloul,AM ,etal.,OccurrenceofPeachlatentmosaicviroidinstonefruitsandits transmissionwithcontaminatedblades.PlantDisease, 1997, 81:154-158.)〇PLMVd 在桃樹上潛隱期可達(dá)5~7年，癥狀一般表現(xiàn)為花葉、延遲發(fā)芽，嚴(yán)重時引起早衰、甚至死 亡（DesvignesGC.PeachlatentmosaicanditsrelationtoPeachyellowmosaic virusdisease.ActaHorticulture, 1986, 193:51-57)。據(jù)報道，在我國遼寧、山東、河 北、陜西，四川，湖北等地樣品檢測到PLMVd，有的果園桃樹PLMVd發(fā)生普遍（張少瑜，張 尊平，洪霓，等.桃潛隱花葉類病毒的鑒定.中國果樹，2000,（1) :30-31.;劉曉，Barba M，Br〇ggi〇M，etal.，四川核果類果樹病毒類病害田間普查與檢測鑒定.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2004，17(5) :613-617.;徐文興，王國平，何云蔚，等.桃潛隱花葉類病毒中國分離株P(guān)3 的克隆與序列分析·植物病理學(xué)報，2005,35(4) :300-304. ;Yu，Y.，Zhao，Z.，Qin，L.，et al. ,IncidenceofmajorpeachvirusesandviroidsinChina.JournalofPlant Pathology, 2013, 95(3) :603-607.)。樓桃綠環(huán)斑駁病毒（Cherrygreenringmottle virus，CGRMV)是李屬植物中發(fā)生較普遍，危害較嚴(yán)重的病毒之一。能侵染多種李屬植物 包括甜櫻桃，酸櫻桃，櫻花，桃和杏（ZhangYP,KirkpatrickBC,SmartCD，etal.cDNA cloningandmolecularcharacterizationofCherrygreenringmottlevirus. JournalofGenVirol, 1998, 79:2275-2281·)。CGRMV屬于線形病毒科（Flxeviiridae) 凹陷病毒屬（Foveavirus)(KingAMQ，AdamsMJ，CarstensEB，etal.Virus taxonomy:classificationandnomenclatureofviruses:Ninthreportofthe internationalcommitteeontaxonomyofviruses.ElsevierAcademicPress,San Diego, 2011.)，該病毒在北美、歐洲、新西蘭、非洲和亞洲等地區(qū)分布極廣。2011年我國 首次利用RT-PCR檢測技術(shù)在甜櫻桃和桃等李屬植物中發(fā)現(xiàn)了CGRMV(ZhouJF，WangG P,KuangR.F. ,etal.FirstreportofCherrygreenringmottlevirusoncherry andpeachgrowninChina.PlantDisease，2011，95(10):1319·)。王文文等（王文文， 宗曉娟，陳立偉，等.山東地區(qū)櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（CGRMV)的RT-PCR檢測及外殼蛋白基因 的克隆.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012,43(2) :206-210,219.)對山東地區(qū)甜 櫻桃生產(chǎn)園進(jìn)行病原檢測，發(fā)現(xiàn)CGRMV發(fā)生較普遍。近年來，我們對我國主要桃產(chǎn)區(qū)病毒 病進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)查及RT-PCR分子檢測，結(jié)果表明：分別在新疆，甘肅，福建，河南，云南，廣 西，河北，北京，山東等地桃樹樣品上均檢測到PLMVd;在山東、福建和甘肅等地桃樹樣品上 檢測到CGRMV(Yu，Y.，Zhao,Z.，Qin，L.，etal.，Incidenceofmajorpeachvirusesand viroidsinChina.JournalofPlantPathology，2013,95 (3) :603-607. )。2013 年6 月 我們對福建不同果園桃樹43個顯癥和不顯癥的樣品進(jìn)行了 6種主要病毒：蘋果褪綠葉斑 病毒（Applechloroticleafspotvirus，ACLSV)，李屬壞死環(huán)斑病毒（Prunusnecrotic ringSpotviru S，PNRSV)，CGRMV，杏假褪綠葉斑病毒（APCLSV)，李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒 (Plumbarknecrosisstempitting-associatedvirus，PBNSPaV)，白蝶蘭（屬）花葉病 毒（Pecteilismosaicvirus，PcMV)，2 種類病毒（PLMVd和啤酒花矮化類病毒（Hopstunt viroid，HSVd)檢測，43個樣品中只檢測到PLMVd，HSVd和CGRMV三種病原，而且，CGRMV主 要是與PLMVd復(fù)合侵染為主，復(fù)合侵染率較高。
[0003] 目前關(guān)于果樹病毒和類病毒檢測方法主要有：生物學(xué)方法、血清學(xué)方法和電子顯 微鏡測定方法和分子生物學(xué)方法。分子生物學(xué)檢測法包括核酸分子雜交和PCR測定法等， 因其快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點，已逐漸成為植物病毒和類病毒研究和檢測的重要方法之一。 雖然PCR，RT-PCR等方法敏感度高，但該方法需要專門的儀器設(shè)備，由于污染，可能產(chǎn)生假 陽性，而核酸分子雜交方法靈敏性和特異性都較強，其中斑點雜交方法在尼龍膜上進(jìn)行，只 要具備探針，檢測操作簡單方便，適合基層應(yīng)用，能夠一次檢測大量樣品。
[0004] 在過去的幾年，同時檢測多種植物病毒非同位素標(biāo)記的分子雜交技術(shù)已成為 重要的途斷方法（reviewsinJamesD.，Varga，A.，Pallas，V.，etal.Strategiesfor simultaneousdetectionofmultipleplantviruses.CanadianJournalofPlant Pathology，2006,28:16-29.)〇Herranzetal. (Herranz,M.C. ,Sanchez-Navarro,J. A.，Aparicio,F.，etal. ,Simultaneousdetectionofsixstonefruitvirusesby non-isotopicmolecularhybridizationusingauniqueriboprobeor'polyprobe' · JournalofVirologicalMethods，2005, 124:49-55.)報道，通過分子克隆和連接，串 聯(lián)幾個病毒核酸序列，合成非同位素標(biāo)記的digoxigenin標(biāo)記的單一分子探針，叫多聚 探針（polyprobe)，能同時檢測六個核果的病毒（蘋果花葉病毒（Applemosaicvirus， ApMV)，PNRSV，李矮縮病毒（Prunedwarfvirus，PDV)，美洲李線紋病毒Americanplum linepatternvirus(APLPV)，李痕病毒（Plumpoxvirus，PPV)，ACLSVD 相比混合在一 起單探針，polyprobe能減少處理時間和總成本。隨后，這方法應(yīng)用于同步檢測核果多個 類病毒（Cohen，0·，Batuman，0·，Stanbekova，G.，etal. ,Constructionofamultiprobe forthesimultaneousdetectionofviroidsinfectingcitrustrees.Virus Genes, 2006, 33:287-292. ；Lin,L. ,Li,R. ,Mock,R. ,etal. ,Developmentofapolyprobe todetectsixviroidsofpomeandstonefruittrees.JournalofVirological Methods，2011，171:91-97.；ZhangZ. ,Peng,S. ,Jiang,D. ,etal. ,Developmentofa polyprobeforthesimultaneousdetectionoffourgrapevineviroidsingrapevine plants.EuropeanJournalofPlantPathology，2012, 132:9-16·)。而同時檢測病毒與 類病毒的polyprobe，目前有一篇報道，Peiroetal(Peiro,Α·，Pallds，V.，S(inchez-Nav arro,J.A. ,Simultaneousdetectionofeightvirusesandtwoviroidsaffecting stonefruittreesbyusingauniquepolyprobe.EuropeanJournalofPlant Pathology，2012, 132:469-475.)在Herranzetal. (Herranz,M.C. ,Sanchez-Navarro,J. A. ,Aparicio,F.,etal. ,Simultaneousdetectionofsixstonefruitvirusesby non-isotopicmolecularhybridizationusingauniqueriboprobeor<polyprobe,. JournalofVirologicalMethods, 2005, 124:49-55.)用多聚探針同時檢測六個核果病毒 的基礎(chǔ)上，又增加了兩個核果病毒和兩個核果類病毒（HSVd，PLMVd)。目前，尚未有用于果 樹病毒和類病毒