用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物的制作方法
【專利說明】用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基組合物
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2013年4月17日提交的美國申請第61/813,034號的優(yōu)先權(quán)及其權(quán) 益，其全部內(nèi)容通過引用的方式全部并入。
【背景技術(shù)】
[0003] 對干細(xì)胞和體細(xì)胞重編程以對人類疾病進(jìn)行建模并找到迫切需要的療法投入大 量希望和努力。最近的諾貝爾醫(yī)學(xué)及生理學(xué)獎(jiǎng)在人類體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞的革命性 方法發(fā)表5年后就授予給Yamanaka博士，說明有多少希望給予在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPSC) 技術(shù)上（Takahashi等人，2007)。之后不久，即表明得自患者皮膚細(xì)胞的IPSC可以在體外 轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元（Dimos等人，2008)。神經(jīng)科學(xué)的科學(xué)家們涌入這個(gè)前所未有的機(jī)會以在體 外獲得得自神經(jīng)和精神障礙患者的活神經(jīng)元培養(yǎng)物并證實(shí)與特定障礙相關(guān)的主要表型可 以在培養(yǎng)皿上顯現(xiàn)（Marchetto 等人·，2010 ;Brennand 等人 2011 ;Marchetto 等人 2011 ; Nguyen 等人 2011 ;Seibler 等人 2011 ;Bellin 等人 2012 ;Egawa 等人 2012 ;Israel 等人 2012 ;Shi 等人 2012)。
[0004] 然而還沒有用完整的神經(jīng)生理學(xué)方法建立使神經(jīng)元體外生長的基本培養(yǎng)條 件。當(dāng)前，幾乎所有人類神經(jīng)元培養(yǎng)物均在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM)中生 長（Cattaneo and McKay, 1990 ;0kabe 等人，1996 ;Soldner 等人，2009 ;Vierbuchen 等 人，2010 ;Brennand 等人，2011 ;Caiazzo 等人，2011 ;Eiraku 等人，2011 ;Marchetto 等 人，2011 ;Nguyen 等人，2011 ;Pang 等人，2011 ;Pfisterer 等人，2011 ;Qiang 等人，2011 ; Soldner 等人，2011 ;Son 等人，2011 ;Boyer 等人，2012 ;Br0z 等人，2012 ;Giorgetti 等 人，2012 ;Israel 等人，2012 ;Shao 等人，2012 ;Vilchez 等人，2012)，偶有在Neurobasal 培 養(yǎng)基（Hermann 等人，2004 ;Li 等人，2005 ;Johnson 等人，2007)或 DMEM 和 Neurobasal 的 混合物（Koch 等人，2009 ;Boulting 等人，2011 ;Kriks 等人，2011 ;Egawa 等人，2012 ;Shi 等人，2012)中生長。之后將多種生長因子和補(bǔ)充物添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以促進(jìn)神經(jīng)元分 化和成活。使用膜片鉗和鈣成像技術(shù)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，廣泛使用的那些基礎(chǔ)培養(yǎng)基完全沒有針 對神經(jīng)生理學(xué)功能進(jìn)行調(diào)整。它們嚴(yán)重地?fù)p害了動(dòng)作電位放電以及興奮性和抑制性突觸功 能，其從而使自發(fā)的神經(jīng)活動(dòng)急劇降低。這進(jìn)而又對功能發(fā)育和體外神經(jīng)元操作具有不利 后果。因而，領(lǐng)域內(nèi)需要一種培養(yǎng)基組合物，其密切反映體內(nèi)生理?xiàng)l件以提供例如成熟神經(jīng) 細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞或原代神經(jīng)細(xì)胞的體外分化、擴(kuò)張或維持過程中的未被折衷的條件。
[0005] 本文在其他之外特別提供可用于培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基組合物。具體而言，本文 提供的組合物模擬活腦中的重要生理?xiàng)l件并保持神經(jīng)活性。在一些實(shí)施方式中，本文提供 的培養(yǎng)基組合物改進(jìn)長期體外培養(yǎng)中人神經(jīng)元分化的效率并促進(jìn)突觸功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本申請?zhí)峁┮环N細(xì)胞培養(yǎng)基，其促進(jìn)在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)的腦細(xì)胞的生長和/或保 持和/或功能活性。在某些實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含一種或多種神經(jīng)活性無機(jī)鹽、和/ 或一種或多種神經(jīng)活性氨基酸、和/或一種或多種維生素、和/或一種或多種氨基酸、和/ 或一種或多種能量基質(zhì)（energetic substrate)、和/或一種或多種pH調(diào)節(jié)劑。
[0007] 在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含濃度為約70mM~約150mM的氯化鈉、濃度為約 0.0 OOOOlmM~約10mM的神經(jīng)活性無機(jī)鹽、濃度為約0.0 OOlmM~約0. 05mM的甘氨酸、濃度 為約0.0 OOlmM~約0. 05mM的L-丙氨酸、和濃度為約0.0 OlmM~約0. 03mM的L-絲氨酸。
[0008] 在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含濃度低于約0. 05mM的L-丙氨酸、濃度低于約 0. 25mM的甘氨酸、濃度低于約0. 25mM的L-絲氨酸、濃度低于約0. 15mM的L-脯氨酸、濃度 低于約0. 60mM的L-精氨酸鹽酸鹽、濃度低于約2. 5mM的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、濃度高 于約0. 41mM的硫酸鎂、濃度高于約1. 05mM的氯化f丐、濃度高于約4. 16mM的氯化鉀、濃度高 于約120. 7mM的氯化鈉、濃度低于約17. 5mM的D-葡萄糖或濃度為約5mM的HEPES。
[0009] 在某些實(shí)施方式中，本申請?zhí)峁┌环N或多種神經(jīng)活性無機(jī)鹽和一種或多種神 經(jīng)活性氨基酸的培養(yǎng)基。在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基還包含一種或多種pH調(diào)節(jié)劑、一種或 多種能量基質(zhì)、一種或多種氨基酸、和/或一種或多種維生素、及其組合。在某些實(shí)施方式 中，培養(yǎng)基的成分以促進(jìn)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的生長、維持和神經(jīng)功能性的量存在。
[0010] 在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含血清。
[0011] 在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含一種或多種能量敏感型成分，其中，該成分與能量 源例如光或電的接觸使得在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的活性增加。在某些實(shí)施方式中，該 成分持續(xù)暴露于能量源引起培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的興奮毒性。
[0012] 在另一方面，提供培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的方法。該方法包括，使神經(jīng)細(xì)胞與本文（包括其 實(shí)施方式）提供的培養(yǎng)基接觸，并使得神經(jīng)細(xì)胞生長，從而培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞。
[0013] 在另一方面，提供在本文（包括其實(shí)施方式）提供的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞。
【附圖說明】
[0014] 圖1A-C :DMEM或Neurobasal基培養(yǎng)基損害神經(jīng)和突觸活性。將iPS或ES細(xì)胞來 源的人類神經(jīng)元直接在玻璃蓋玻片上鋪板。將單個(gè)成熟神經(jīng)元的基礎(chǔ)神經(jīng)元功能在兩個(gè)經(jīng) 典細(xì)胞外基礎(chǔ)培養(yǎng)基（DMEM/F12或Neurobasal-A)中測試并比較。將細(xì)胞外培養(yǎng)基的灌注 從ACSF切換到DMEM/F12或Neurobasal-A，并換回ACSF以進(jìn)行恢復(fù)。A.鈣成像分析示出在 ACSF、DMEM/F12并回到ACSF中記錄的同一視野的1 Omin視頻中自發(fā)活性細(xì)胞的數(shù)量。ACSF 的無機(jī)鹽濃度和摩爾滲透壓濃度與DMEM匹配?；揖€表示各個(gè)視野。統(tǒng)計(jì)用Wilcoxon測試 進(jìn)行，= 0. 009, *P = 0. 022)。B.頂部追蹤痕跡:電流鉗記錄揭示出在ACSF中觀察到 的自發(fā)動(dòng)作電位在DMEM中快速消失，伴隨有靜息膜電位的較大增加。中間追蹤痕跡:電壓 鉗記錄（于70mV，C1-逆轉(zhuǎn)電位）表明DMEM基培養(yǎng)基引發(fā)較大的Na+內(nèi)向電流并完全阻斷 自發(fā)的AMPA突觸活性。底部追蹤痕跡:電壓鉗記錄（于OmV，Na+逆轉(zhuǎn)電位）示出DMEM基 培養(yǎng)基引發(fā)較大的C1-電流并完全阻斷自發(fā)的GABA突觸活性。C.頂部追蹤痕跡（突觸活 性）:電位鉗記錄示出Neurobasal-A基培養(yǎng)基強(qiáng)烈地降低自發(fā)的AMPA突觸活性。此外，其 也引發(fā)較大的緊張性C1-電流并完全阻斷自發(fā)的GABA突觸活性。底部追蹤痕跡（動(dòng)作電 位）：NB-A并不影響靜息膜電位佰其強(qiáng)烈地破壞誘發(fā)動(dòng)作電位(電流階躍500ms)、電壓依 賴的Nav/Kv電流（IV追蹤痕跡，鉗-70mV，電壓階躍5mV)和自發(fā)動(dòng)作電位。
[0015] 圖2A-G :BrainPhys支持高效的動(dòng)作電位活性。A.盡管電壓門控電流的峰值可以 在單個(gè)神經(jīng)元之間有變化，它們在BrainPhys和ACSF中是相似的。各個(gè)神經(jīng)元均在ACSF 和BrainPhys中測試（黑色vs.藍(lán)色點(diǎn)）。非參配對Wilcoxon檢驗(yàn)P值以斜體示出。柱 狀圖表示均值土標(biāo)準(zhǔn)誤。B.靜息膜電位、自發(fā)和誘發(fā)動(dòng)作電位在ACSF和BrainPhys中相 同。C.膜片鉗處理的典型成熟神經(jīng)元表達(dá)光基因（optogene)(突觸蛋白：Cheta-YFP)并填 充有若丹明。神經(jīng)元活性的光基因控制可以可靠地在BrainPhys中實(shí)現(xiàn)。D.在BrainPhys 或Neurobasal-A中以相同參數(shù)測試的單個(gè)成熟神經(jīng)元表明，光基因控制在BrainPhys中 得到顯著改善。E.單個(gè)神經(jīng)元的電壓門控Nav和Kv電流的最大振幅（由IV曲線測定的， 鉗-70mV，階躍5mV)與BrainPhys (藍(lán)色點(diǎn)）或ACSF (黑色點(diǎn)）相比在Neurobasal培養(yǎng)基 中（紅色點(diǎn)=Neurobasal_A，橘色點(diǎn)=Neurobasal)顯著減少。F.興奮性（AMPA)和抑制 性（GABA)突觸活性在BrainPhys培養(yǎng)基中均很明顯。在記錄單個(gè)神經(jīng)元的自發(fā)突觸活性 的同時(shí)灌注不同培養(yǎng)基表明與其他培養(yǎng)基例如Neurobasal-A相比，BrainPhys更好地支持 突觸功能。十二次掃描以灰色疊印，且為清楚起見，其中之一以黑色突出顯示。G.在ACSF 和BrainPhys的存在下，以鈣成像在網(wǎng)絡(luò)水平測試的自發(fā)活性。
[0016] 圖3A-D :健康、成熟且有活力的神經(jīng)元在BrainPhys基培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。A.在具 有補(bǔ)充物的BrainPhys中生長超過4周的人IPSC來源的典型神經(jīng)元培養(yǎng)物的免疫染色。 B-C.在BrainPhys-補(bǔ)充物中成熟3~6周的典型功能性神經(jīng)元的電生理活性。膜片鉗記 錄也在BrainPhys培養(yǎng)基中進(jìn)行。B.從左到右:由較小的500ms去極化電流階躍或簡單的 閃光（syn :Cheta-YFP)誘發(fā)的一系列動(dòng)作電位。IV追蹤痕跡（鉗-70mV，階躍5mV)示出典 型的電壓依賴的Na+和鉀電流。自發(fā)動(dòng)作電位記錄在電流鉗中。C.由AMPA受體（對NBQX 敏感，電壓鉗于_70mV)和GABA受體（對Gabazine敏感，電壓鉗于OmV)介導(dǎo)的自發(fā)突觸反 應(yīng)。D.鈣成像示出在BrainPhys-補(bǔ)充物中生長并記錄的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)活性。時(shí)間序列 分析對于目標(biāo)活性區(qū)進(jìn)行做圖。
[0017] 圖4A-J :與基于DMEM/H2或Neurobasal培養(yǎng)基相比，在BrainPhys培養(yǎng)基中培 養(yǎng)的人神經(jīng)元的特征。A-G.在三個(gè)并排生長的培養(yǎng)物中觀察到的代表性免疫染色。細(xì)胞 核用DAPI染色（藍(lán)色）。盡管存在一些不同，在人神經(jīng)元的存活、神經(jīng)元亞型（例如，多巴 胺能的、Gaba能的）的比例以及近端突觸斑（synaptic puncta)的數(shù)量方面沒有明顯的 差異。H.神經(jīng)元的功能類型基于其響應(yīng)于500ms電流去極化階躍時(shí)的放電模式而進(jìn)行界 定。I.為將BrainPhys對功能性成熟的影響進(jìn)行表征，將神經(jīng)元在相同培養(yǎng)板中培養(yǎng)于 BrainPhys或DMEM/F12基培養(yǎng)基中。膜片鉗在ACSF中用盲法進(jìn)行。在BrainPhys培養(yǎng)物 中發(fā)現(xiàn)更高比例的成熟5型神經(jīng)元。BrainPhys培養(yǎng)物也示出更高比例的接收功能性AMPA 突觸輸入（NBQX敏感的）或GABA突觸輸入（Gabazine敏感的）的神經(jīng)元（3、4和5型），其 由在電壓鉗（分別為_70mV或OmV)4min記錄中以不同動(dòng)力學(xué)具有至少5個(gè)自發(fā)突觸反應(yīng) 而確定。J.不同iPS細(xì)胞系來源并在ACSF中膜片鉗處理的較多神經(jīng)元樣本的進(jìn)一步分析 證實(shí)，在基于BrainPhys的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)神經(jīng)元在相當(dāng)程度上增加獲得有突觸活性的神 經(jīng)元的機(jī)會。
[0018] 圖5A-C :基于BrainPhys的神經(jīng)元培養(yǎng)基允許有效直接的神經(jīng)元轉(zhuǎn)化（iN)以及 人iN細(xì)胞的功能性成熟并增加 ARC蛋白表達(dá)。A.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：能夠iN的HDF在NC培養(yǎng)基中 轉(zhuǎn)化三周。對于成熟，將iN細(xì)胞迀移至星形細(xì)胞上并進(jìn)一步在匪培養(yǎng)基中培養(yǎng)。B.在3 周轉(zhuǎn)化后，對于β-ΙΙΙ-微管蛋白、hTau、MAP2ab和NeuN進(jìn)行免疫熒光染色。標(biāo)尺：50μπι。 C.在星形細(xì)胞上成熟后的6周齡iN細(xì)胞中hTau和ARC的免疫熒光染色的代表性圖片和分 析。在ImageJ中使用ROI選擇進(jìn)行的定量和測量。標(biāo)尺：100μπι。在得自三個(gè)供體的iN 培養(yǎng)物中的神經(jīng)元ARC水平的定量?；疑c(diǎn)代表各個(gè)細(xì)胞（平均η = 38/組，最小η = 19/ 組）。條狀物示出各組的均值土SEM。*Ρ〈0· 05, #Ρ〈0· 01，*#Ρ〈(λ 001，##Ρ〈(λ 0001。
[0019] 圖6A-C示出使用多電極陣列（ΜΕΑ)在數(shù)周中對BrainPhys中人神經(jīng)元的電活性 的測試，并與當(dāng)前所用的條件比較。BrainPhys提高長期神經(jīng)元活性。A.向成熟培養(yǎng)基中 添加血清（例如，血清替代物（knockout serum)，胎牛血清FBS)強(qiáng)烈地破壞神經(jīng)元功能。 B.與所測試的NB/DMEMF12混合物或DMEM/F12相比，BrainPhys減少由飼養(yǎng)循環(huán)引起的變 化性并且改善和保持長期神經(jīng)元功能。C.與具有相同的不含血清的補(bǔ)充物的iCell神經(jīng)元 培養(yǎng)基或Neurobasal相比，經(jīng)補(bǔ)充但不含血清的BrainPhys在數(shù)周中改善并保持神經(jīng)元活 性。
[0020] 圖7A-C :示出并在BrainPhys-補(bǔ)充物中培養(yǎng)的帕金森患者iPSC來源的神經(jīng)元的 活性。A.示出iPSC來源神經(jīng)元的生成的圖。B.帕金森患者iPSC來源的有活性的活腦細(xì) 胞在于BrainPhys中培養(yǎng)后進(jìn)行TUJ-1和GFAP染色。C.健康受試者和帕金森患者的神經(jīng) 元細(xì)胞的活性。
[0021] 圖8A-G :健康和有活性的大鼠原代海馬神經(jīng)元在BrainPhys中的分化。A-G.在 BrainPhys+補(bǔ)充物（sml)中生長2~3周的典型功能性神經(jīng)元的電生理活性。A.圖表示 出來自大鼠海馬的原代神經(jīng)元在BrainPhys+sml中培養(yǎng)2周多，之后進(jìn)行功能分析。B.填 充有若丹明的典型膜片鉗處理的神經(jīng)元的圖像。在右邊，較亮的白色陰影為若丹明填充的 膜片鉗電極。C.由較小的500ms去極化電流階躍誘發(fā)的一些列動(dòng)作電位，且IV追蹤痕跡 (鉗-70mV，階躍5mV)示出典型的電壓-依賴的Na+和K+電流。著色的追蹤痕跡與不同的 電壓階躍對應(yīng)。D.在電流鉗中記錄的自發(fā)動(dòng)作電位。E.在電壓鉗（OmV)記錄的自發(fā)GABA 突觸反應(yīng)。F.在電壓鉗（_70mV)中記錄的自發(fā)AMPA突觸反應(yīng)。G.在膜片鉗和免疫組化操 作后固定蓋玻片。用MAP2對樹突染色，用突觸蛋白對突觸前末梢染色，并用DAPI對細(xì)胞核 染色。
[0022] 圖9A-C :DMHM使每一個(gè)被檢測神經(jīng)元的膜電位去極化，在大多數(shù)情況中，其也會 使自發(fā)動(dòng)作電位放電飽和并沉默。該追蹤痕跡得自對ACSF或DMEM中干細(xì)胞來源的人神經(jīng) 元的全細(xì)胞電位鉗自發(fā)記錄。A.DMEM沒有使動(dòng)作電位放電飽和并沉默的罕見例子。B-C. 兩個(gè)其他常規(guī)例子，其中DMEM引發(fā)的去極化使自發(fā)動(dòng)作電位放電沉默。
[0023] 圖10 :DMHM引發(fā)較大的C1-電流并阻斷自發(fā)的抑制性突觸活性。常規(guī)神經(jīng)元的電 壓鉗記錄（OmV)示出，在ACSF中的自發(fā)GABA突觸活性可被DMEM阻斷并且可以恢復(fù)。頂部 的追蹤痕跡表示常規(guī)的GABA反應(yīng)，其在ACSF中但無法在DMEM中看到。底部的追蹤痕跡是 改變灌注時(shí)相應(yīng)的連續(xù)記錄，示出在DMEM灌注發(fā)生時(shí)的較大C1-流以及后續(xù)的平穩(wěn)期。
[0024] 圖11A-D :移除培養(yǎng)基的所有維生素、所有氨基酸或所有額外組分的DMEM。通過移 除大量氨基酸，DMEM引發(fā)的造成DMEM中動(dòng)作電位和突觸活性破壞的去極化被避免。然而， 該溶液無法在長于一周的時(shí)間中保持神經(jīng)元的發(fā)育和存活。
[0025] 圖12 :向BrainPhys基礎(chǔ)培養(yǎng)基急性地（acutely)添加完整一套的常用補(bǔ)充物 (N2、B27、視黃酸、BDNF、⑶NF、抗壞血酸、cAMP、層粘連蛋白和膽固醇）并不影響放電率或興 奮性/抑制性突觸活性。
[0026] 圖13A-C.小鼠腦切片（取自活體）在BrainPhys中的膜片鉗記錄。A-C. BrainPhys 中得自成年小鼠海馬的常規(guī)功能性顆粒神經(jīng)元的膜片鉗處理。A.自靜息膜電位經(jīng)500ms電 流階躍誘發(fā)的動(dòng)作電位。B.示出Nav和Kv電流的增量5mV階躍（靜息-70mV)的IV追蹤 痕跡。C.自發(fā)AMPA突觸反應(yīng)（電位鉗-70mV)。
[0027] 圖14A-B :Neurobasal引起較大的C1-電流并阻斷自發(fā)的抑制性突觸活性。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本公開至少部分基于促進(jìn)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的生長和維持以及功能活 性的培養(yǎng)基的發(fā)現(xiàn)。具體而言，本申請公開了，該培養(yǎng)基可以包含神經(jīng)活性無機(jī)鹽、神經(jīng)活 性氨基酸、pH調(diào)節(jié)劑、能量基質(zhì)、氨基酸和維生素的組合。在某些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基的成 分以促進(jìn)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的生長、維持和神經(jīng)功能性的量存在。
[0029] I.宙義
[0030] 除非另外指出，本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 相同的含義。參見，例如，Singleton 等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2nd ed.，J.Wiley&Sons (New York，NY 1994) ;Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor, NY 1989)。與本文所述的那些相似或等同的任何方法、裝置和材料可以用在本發(fā)明的實(shí)施中。 提供以下定義幫助對本文常用的某些術(shù)語的理解，并不意在限制本公開的范圍。
[0031] 術(shù)語"氨基酸"是指天然存在的以及合成的氨基酸，以及以與天然存在氨基酸相似 的方式進(jìn)行作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的 那些，以及在之后進(jìn)行修飾的那些氨基酸，例如羥基脯氨酸、γ -羧基谷氨酸和〇-磷酸絲氨 酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，與氫、 羧基、氨基以及R基連接的α碳，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基 锍。這些類似物具有修飾的R基（例如，正亮氨酸）或修飾的肽骨架，但是保留與天然存在 的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物是指結(jié)構(gòu)不同于氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)、但 以與天然存在氨基酸相似的方式進(jìn)行作用的化合物。術(shù)語"非天然存在的氨基酸"和"非天 然氨基酸"是指無法在自然界找到的氨基酸類似物、合成氨基酸和氨基酸模擬物。
[0032] 氨基酸在本文中可以用它們通常已知的三字母符號或用IUPAC-IUB生物化學(xué)命 名委員會建議的單字母符號進(jìn)行指代。同樣地，核苷酸可以通過其一般認(rèn)可的單字母代碼 進(jìn)行指代。
[0033] "細(xì)胞培養(yǎng)物"是存在于生物體外部的體外細(xì)胞群。細(xì)胞培養(yǎng)物可以由分離自細(xì)胞 庫或動(dòng)物的原代細(xì)胞建立、或由得自這些來源中的一種并在長期體外培養(yǎng)中永生化的次生 細(xì)胞建立。
[0034] 當(dāng)提及細(xì)胞培養(yǎng)物自身或其培養(yǎng)操作時(shí)，術(shù)語"培養(yǎng)"、"生長"、"保持"、"擴(kuò)張"等 可以互換地用于表示細(xì)胞在適合于成活的條件下在體外保持（例如，離體的（ex vivo))。 培養(yǎng)的細(xì)胞可以存活，并且培養(yǎng)可以引起細(xì)胞生長、分化或分裂。術(shù)語并不暗示著培養(yǎng)物中 的所有細(xì)胞均存活或生長或分裂，因?yàn)橛幸恍┛赡茏匀凰ダ系?。?xì)胞通常在培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 培養(yǎng)基可以在培養(yǎng)過程中變化。
[0035] 術(shù)語"介質(zhì)"、"培養(yǎng)基"和"培養(yǎng)溶液"是指細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。培養(yǎng)基通常為等滲溶 液，并且可以是液體、膠狀或半固體，例如，提供用于細(xì)胞粘附或支持的基質(zhì)。本文所用的培 養(yǎng)基可以包含培養(yǎng)細(xì)胞所需的營養(yǎng)、化學(xué)和結(jié)構(gòu)支撐的組分。
[0036] 如本文所用，在培養(yǎng)等中的"允許生長的條件"是指在合適的培養(yǎng)基中（包含鹽、 緩沖劑、血清）使得細(xì)胞能夠進(jìn)行細(xì)胞分裂或至少保持存活至少24小時(shí)、優(yōu)選更長時(shí)間 (例如，數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月）的溫度（對于哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常為約37°C )、濕度、C02(通常為 約5%)的條件。
[0037] 當(dāng)提及細(xì)胞或生物樣本時(shí)，術(shù)語"源自"表明細(xì)胞或樣本在某些時(shí)間點(diǎn)從所述的來 源獲得。例如，源自個(gè)體的細(xì)胞可以表示直接從個(gè)體獲得的原代細(xì)胞（即，未修飾的），或者 可以例如通過引入重組載體、通過在特定條件下培養(yǎng)、或永生化