用于提取和儲(chǔ)存核酸的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于提取和儲(chǔ)存核酸的方法和組合物
[0001] 與相關(guān)申請的交叉引用 本申請為于2012年4月30日提交的標(biāo)題為"用于提取和儲(chǔ)存核酸的方法和組合物"的 美國專利申請?zhí)?3/460076和于2012年12月20日提交的標(biāo)題為"用于在固體基質(zhì)上穩(wěn)定 核酸的配方"的美國專利申請?zhí)?3/721948的部分繼續(xù)；所述兩個(gè)申請通過引用結(jié)合到本 文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于以干燥形式從生物樣品環(huán)境提取和穩(wěn)定核酸的固體基質(zhì)和方法。 還描述了用于收集、提取、保存和從干燥固體基質(zhì)回收核酸的方法。
[0003] 發(fā)明背景 從生物樣品分離或純化期間保持生物分子的結(jié)構(gòu)和功能完整性對各種下游應(yīng)用至關(guān) 重要。純化的生物分子的下游應(yīng)用可包括分析物檢測、傳感、法醫(yī)、診斷或治療應(yīng)用、測序、 擴(kuò)增等。這些下游應(yīng)用的成功可依賴于維持靶生物分子的完整結(jié)構(gòu)和功能。多種因素，例 如溫度、壓力、pH、化學(xué)或酶水解或污染物的存在可引起生物分子例如DNA、RNA或蛋白質(zhì)的 降解。
[0004] 由于化學(xué)自我水解和酶介導(dǎo)的降解，RNA為最不穩(wěn)定的生物分子之一。衍生自生 物樣品的RNA的提取和穩(wěn)定對許多環(huán)境因素敏感，包括，但不限于，用于提取或收集RNA的 緩沖劑、溶液pH、溫度，和特別地?zé)o處不在的強(qiáng)健的核糖核酸酶（RNA酶）。RNA通常以純化 和未純化的形式二者在冷凍下（例如4°C、_20°C或_80°C)儲(chǔ)存以防止水解和酶降解，并因 此保持RNA樣品的完整性。為了避免與用于維持RNA樣品完整性的冷凍相關(guān)的費(fèi)用和空間 需求，用于在環(huán)境溫度下提取和穩(wěn)定RNA的方法和物品是期需的。
[0005] 當(dāng)前用于在環(huán)境溫度下穩(wěn)定RNA的方法學(xué)集中于在過量，例如，去污劑、離液化合 物、還原劑、過渡金屬、有機(jī)溶劑、螯合劑、蛋白酶、RNA酶肽抑制劑和抗-RNA酶抗體的液體 溶液中滅活RNA酶。另外的嘗試集中于RNA的化學(xué)修飾以限制酯交換和自我水解。要求 以干燥形式成功收集和保存RNA的干燥-狀態(tài)技術(shù)通常需要RNA在RNA儲(chǔ)存前從樣品"預(yù) 先純化"和濃縮。其它用于以干燥形式保存RNA的干燥-狀態(tài)技術(shù)需要另外的干燥設(shè)施 (例如強(qiáng)制空氣流、凍干或熱處理）。因此這些方法在無顯著的樣品處理下不可執(zhí)行（not conductive to)從樣品（例如，生物樣品）直接收集RNA。
[0006] 因此，需要使在單個(gè)處理步驟內(nèi)于環(huán)境條件下從生物樣品的干燥-狀態(tài)RNA提取 和穩(wěn)定成為可能的組合物和方法。此外，在環(huán)境溫度下將干燥的生物樣品儲(chǔ)存相當(dāng)長一段 時(shí)間和其后回收完整的RNA用于進(jìn)一步分析的能力是非常合乎需要的。
[0007] 發(fā)明概述 固體基質(zhì)的一個(gè)實(shí)施方案包含至少一種蛋白變性劑和至少一種酸或酸-滴定的緩沖 試劑，其以干燥狀態(tài)漫布于其中；其中所述基質(zhì)配置為當(dāng)水化時(shí)提供酸性PH、從樣品提取 核酸和在環(huán)境溫度下以基本上干燥的狀態(tài)儲(chǔ)存核酸。
[0008] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，RNA提取基質(zhì)包含包括離液劑、去污劑或其組合在內(nèi)的蛋白 變性劑；和酸或酸-滴定的緩沖試劑，其以干燥狀態(tài)漫布于其中，其中所述基質(zhì)為多孔的不 可溶性干燥材料，其配制為當(dāng)水化時(shí)提供2-7的pH，用于提取RNA和穩(wěn)定所提取的RNA，所 述提取的RNA具有至少4的RNA完整性數(shù)值（RIN)。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA提取基質(zhì)包含包括離液劑、去污劑或其組合在內(nèi)的蛋白變 性劑；酸或酸-滴定的緩沖試劑；和包括三磷酸鹽或焦磷酸鹽在內(nèi)的RNA酶抑制劑，其以干 燥狀態(tài)漫布于其中，其中所述基質(zhì)包括多孔的不可溶性干燥材料，其配制為當(dāng)水化時(shí)提供 2-7的pH，和穩(wěn)定RNA，該RNA具有至少4的RNA完整性數(shù)值（RIN)。
[0010] 用于從樣品提取和儲(chǔ)存核酸的方法的一個(gè)實(shí)例包括以下步驟：向包含蛋白變性劑 和酸或酸滴定的緩沖試劑的干燥固體基質(zhì)提供樣品；當(dāng)水化時(shí)產(chǎn)生酸性pH用于從樣品提 取核酸；干燥包含所提取的核酸的基質(zhì)；和在環(huán)境溫度下以基本上干燥的狀態(tài)在基質(zhì)上儲(chǔ) 存提取的核酸。
[0011] 附圖 當(dāng)參考附圖閱讀下列詳述時(shí)將更好地理解本發(fā)明的這些及其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)，在 整個(gè)附圖中相似的字符代表相似的部分，其中： 圖1為P31 NMR譜，其顯示三（2-羧乙基）膦（TCEP)的氧化和TCEP氧化物（TCEP-0) 的制備。
[0012] 圖2顯示衍生自TCEP和TCEP-0對纖維素樣品的還原活性的5, 5' -二硫雙-(2-硝 基苯甲酸）（DTNB)比色測定法的條形圖。
[0013] 圖3顯示在包含TCEP或TCEP-0的化學(xué)處理的纖維素紙上收集的干燥血斑的RNA 完整性數(shù)值（RIN)。
[0014] 圖4顯示在多種化學(xué)處理的纖維素基質(zhì)上收集并在Agilent 2100 Bioanalyzer 上分析RNA之前于環(huán)境溫度下儲(chǔ)存5、6或12天的干燥血斑的RNA完整性數(shù)值（RIN)。
[0015] 發(fā)明詳述 本發(fā)明的實(shí)施方案提供用于環(huán)境提取和保存核酸，例如RNA的合適的基質(zhì)和方法。RNA 一般被認(rèn)為是難以以完整形式保存的不穩(wěn)定分子。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案涉及一種 核酸提取基質(zhì)，其中所述基質(zhì)配置為在單個(gè)處理步驟內(nèi)從生物樣品收集、提取和儲(chǔ)存核酸 達(dá)很長的時(shí)間，隨后在各種應(yīng)用中使用。所述基質(zhì)配置為在環(huán)境溫度下以基本上干燥的狀 態(tài)儲(chǔ)存核酸和基本上保留核酸的完整性。
[0016] 為了更清楚和簡明地描述所要求發(fā)明的主題，針對在下面的描述和所附權(quán)利要求 中使用的特殊術(shù)語提供下列定義。在整個(gè)說明書中，特殊術(shù)語的例示應(yīng)被視為為非-限制 性的實(shí)例。
[0017] 單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"所述"包括復(fù)數(shù)提及物，除非上下文另外清楚指示。近 似的語言，如本文遍及說明書和權(quán)利要求所使用的，可應(yīng)用于修飾任何數(shù)量表述，所述數(shù)量 表述可在不導(dǎo)致與其相關(guān)的基本功能的改變的情況下獲準(zhǔn)變化。相應(yīng)地，由術(shù)語例如"約" 所修飾的值不限于所指定的精確值。在一些情況下，近似的語言可相應(yīng)于用于測量該值的 儀器的精密度。必要時(shí)，提供范圍，并且那些范圍包含其間的所有亞范圍。
[0018] 如本文所提及的術(shù)語"核酸"包括所有形式的RNA (例如，mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、 piRNA、ncRNA)、DNA (例如基因組DNA、mtDNA)，以及重組RNA和DNA分子或使用核苷酸類似 物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸可為單鏈的或雙鏈的。核酸可包含編碼或非編碼鏈。 該術(shù)語還包括核酸的片段，例如可使用所公開的提取方法回收的天然存在的RNA或DNA。 "片段"指核酸（例如，RNA或DNA)的一部分。
[0019] 如本文所提及的術(shù)語"生物樣品"包括，但不限于，從任何生物體，包括人，獲得的 血液、血清、組織和唾液。生物樣品可由經(jīng)受自我-診斷測試（例如，血糖監(jiān)測）的個(gè)體或 由受過培訓(xùn)的醫(yī)學(xué)專業(yè)人員通過包括，例如，使用針吸血或刮或拭抹特定區(qū)域如患者皮膚 上的損傷在內(nèi)的多種技術(shù)獲得。用于收集各種生物樣品的方法為本領(lǐng)域所熟知。術(shù)語"樣 品"包括如上所定義的生物樣品，但還包括，例如，組織培養(yǎng)的細(xì)胞和純化的核酸。
[0020] 如本文所提及的術(shù)語"還原劑"包括向另一種化學(xué)物類提供電子的任何化學(xué)物類。 本領(lǐng)域已知多種還原劑。示例性的還原劑包括二硫蘇糖醇（DTT)、2-巰基乙醇（2-ME)和三 (2-羧乙基）膦（TCEP)。此外，可使用這些或其它還原劑的任何組合。在具體的實(shí)施方案 中，還原劑為TCEP。
[0021] 如本文所使用的術(shù)語"緩沖劑"包括，例如2-氨基-2-羥甲基-丙烷-1，3-二醇 (Tris)、2-(A嗎啉代）乙磺酸（MES)、3-(A嗎啉代）丙磺酸（M0PS)、檸檬酸鹽緩沖劑、 4-(2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES)，和磷酸鹽緩沖劑。該潛在的緩沖劑的列表僅用于 說明性目的。選擇用于本文所公開組合物和方法的緩沖劑的pH通常經(jīng)酸滴定在2-7的范 圍內(nèi)。
[0022] 固體基質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案包含至少一種蛋白變性劑和至少一種酸或 酸-滴定的緩沖試劑，其以干燥狀態(tài)漫布于其中，其中所述基質(zhì)配置為當(dāng)水化時(shí)提供酸性 pH。所述基質(zhì)還配置為從樣品提取核酸和在環(huán)境溫度下以基本上干燥的狀態(tài)保存核酸。如 本文所使用的，術(shù)語"基本上干燥的狀態(tài)"指進(jìn)一步干燥樣品至具有約小于2%的水含量。
[0023] 用于從樣品提取和儲(chǔ)存核酸的固體基質(zhì)包含呈干燥狀態(tài)的至少一種酸或酸-滴 定的緩沖劑和蛋白變性劑。術(shù)語"基質(zhì)"在本文中與"提取基質(zhì)"可交換地使用。如本文所 使用的術(shù)語"固體基質(zhì)"指不可溶的基質(zhì)。所述基質(zhì)使得能夠不溶解基質(zhì)材料而收集、提取 和儲(chǔ)存核酸。所述固體基質(zhì)包括，但不限于，諸如纖維素、醋酸纖維素、硝酸纖維