用于檢測(cè)和測(cè)定仙茅苷的抗體、方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及小分子半抗原的抗體及其制備方法與應(yīng)用，特別是涉及仙茅苷及其衍 生物的抗體及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量仙茅苷的方法和試劑盒，以及其中使用的半抗原、免 疫原、偶聯(lián)物（conjugate)和抗體。
[0003] 其中"檢測(cè)"是指定性分析物質(zhì)是否存在。
[0004] 其中"測(cè)定"是指對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。
[0005] 仙茅是仙茅科仙茅屬植物仙茅（Curculigo orchioidesGaertn.)的干燥根莖，仙 茅苷則是仙茅中的主要活性成分，仙茅苷屬于酚苷類化合物。
[0006] 分子式：C22H26011 分子量：466. 44
[0007] 仙茅為石蒜科植物仙茅Curculigo or chioides Gaerth.的干燥根莖。具補(bǔ)腎陽(yáng)， 強(qiáng)筋骨，祛寒濕的功效。用于陽(yáng)痿精冷，筋骨痿軟，腰膝冷痹，陽(yáng)虛冷瀉。研究表明，仙茅中 的主要有效成分仙茅苷（curculigoside)能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增生能力和吞噬作用，提高機(jī) 體的免疫功能，仙茅苷顯示多種生物學(xué)活性和藥理作用?，F(xiàn)代藥理研究顯示仙茅苷具有清 除自由基、增強(qiáng)免疫作用、延緩生殖系統(tǒng)老化、抗骨質(zhì)疏松、補(bǔ)腎壯陽(yáng)、保肝、保護(hù)心血管系 統(tǒng)等作用。
[0008] 目前建立了多種仙茅苷的定性與定量檢測(cè)和測(cè)定分析方法，如薄層層析法、HPLC 法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色譜法。但含仙茅苷的生物樣品（包括血 漿、尿、唾液等）含有大量的影響含量測(cè)定的蛋白質(zhì)及內(nèi)源性物質(zhì)；同時(shí)還需要濃縮以滿足 儀器檢測(cè)靈敏度的要求，處理程序復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；另外由于仙茅苷進(jìn)入體內(nèi)后，組織中的 分布是極其微量的，即使經(jīng)過富集，進(jìn)行含量測(cè)定仍是極其困難的。最后，對(duì)于仙茅苷在靶 器官和組織中分布，以及細(xì)胞和亞細(xì)胞定位的研究，需要通過免疫組織化學(xué)和westblot等 方法，但由于缺乏仙茅苷的抗體，阻礙了此方面的研究。因此，有必要開發(fā)出一種用于檢側(cè) 和測(cè)定生物樣品中仙茅苷的方法，對(duì)闡明相關(guān)藥材或復(fù)方的作用機(jī)理，以及其體內(nèi)分布和 代謝研究，將具有特別的價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的半抗原仙茅苷可提供確定的結(jié)構(gòu)性抗原決定部位，但是它本身并不具備 免疫原性，因此必須要偶聯(lián)到適宜的賦予抗原性的載體物質(zhì)上，這樣所形成的免疫原才會(huì) 在注射到宿主動(dòng)物體內(nèi)后誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供一種如下結(jié)構(gòu)的免疫原：
[0010]
[0011] 其中R是0至6個(gè)碳的烷基橋（連接半抗原與載體物質(zhì)的橋），優(yōu)選R = 0,即PI 直接與仙茅苷氧化后的醛基結(jié)合，或R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不 飽和的亞烷基，更優(yōu)選R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞烷基。
[0012] P1是賦予抗原性的載體物質(zhì)。載體物質(zhì)選自蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片合成的多肽或半 合成的多肽。其中蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目鏡蛋白和脂蛋白， 優(yōu)選為牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、鎖眼形血藍(lán)蛋白 (keyhole limpet haemocyanin，KLH)，更優(yōu)選自鎖眼形血藍(lán)蛋白或牛血清蛋白（BSA)。合 成多肽或半合成多肽是具有足夠數(shù)量的可利用氨基的合成聚氨基酸，優(yōu)選多聚賴氨酸。合 成或天然聚合物是帶有反應(yīng)官能基的聚合物材料，特別是能夠結(jié)合到半抗原產(chǎn)生免疫原的 碳水化合物、酵母或多糖。
[0013] 半抗原的制備本發(fā)明描述了半抗原仙茅苷的糖苷結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)鄰羥基經(jīng)過過碘 酸鈉氧化為醛基從而與載體物質(zhì)發(fā)生的偶聯(lián)作用，產(chǎn)生免疫原。偶聯(lián)物成功制備并純化后 分別經(jīng)質(zhì)譜（MS)和核磁共振氫譜和碳譜（1HNMR和13CNMR)確證。
[0014] 免疫原的合成本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域已知的任何連 接方式。例如過碘酸鈉氧化法等。采用過碘酸氧化法制備免疫原時(shí)，是將10毫克的半抗原 仙茅苷溶解在〇. 2%甲基纖維素鈉水溶液中，加入含有9毫克的過碘酸鈉溶液0. 5毫升，室 溫下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，離心，取上清液加入到10mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌 反應(yīng)6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.0 lmol/L的PBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存 于-20°C的冰箱中。
[0015] 合成免疫原的分析方法為了確認(rèn)載體物質(zhì)上結(jié)合有適當(dāng)?shù)陌肟乖诿庖咔?，?用紫外分光度法或矩陣輔助紫外激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-T0F MS)對(duì)每個(gè)免 疫原進(jìn)行評(píng)估。仙茅苷免疫原反應(yīng)物和產(chǎn)物的吸收峰相比（200nm-400nm)，可判斷是否偶 合，并根據(jù)反應(yīng)物和產(chǎn)物的摩爾吸光系數(shù)計(jì)算偶聯(lián)物與半抗原的比例。
[0016] 使用voyager STR生物分光度測(cè)量方法研究站激光解析質(zhì)譜與延遲萃取結(jié)合進(jìn)行 MALDI-T0F質(zhì)譜。將每個(gè)要分析的等分試樣在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀釋制成lmg/ml 的試樣溶液。使用芥子酸基質(zhì)和牛血清白蛋白作為外標(biāo)分析等分試樣（luL)。
[0017] 對(duì)于優(yōu)選的載體物質(zhì)，牛血清白蛋白或KLH而言，優(yōu)選半抗原與蛋白質(zhì)的結(jié)合比 為 6-15 : 1。
[0018] 第二方面，免疫檢測(cè)時(shí)需要將仙茅苷與標(biāo)記試劑進(jìn)行偶合。因此，本發(fā)明提供一種 如下結(jié)構(gòu)的偶合物；
[0019]
[0020] 其中R是〇至6個(gè)碳的烷基，P2是可檢測(cè)的標(biāo)記試劑，標(biāo)記試劑選自酶、發(fā)光物質(zhì)、 放射性物質(zhì)或它們的混合物，更優(yōu)選地標(biāo)記試劑是過氧化物酶。最優(yōu)選地標(biāo)記試劑是辣根 過氧化物酶（HRP)。發(fā)光物質(zhì)選自生物發(fā)光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或熒光物質(zhì)。
[0021] 偶合物的合成本發(fā)明的半抗原和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域已知的任何連 接方式。例如過碘酸鹽氧化法等。采用過碘酸氧化法制備免疫原時(shí)，是將10毫克的半抗原 仙茅苷溶解在〇. 2%甲基纖維素鈉水溶液中，加入含有9毫克的過碘酸鈉溶液0. 5毫升，室 溫下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，離心，取上清液加入到10mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌 反應(yīng)6小時(shí)，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.0 lmol/L的PBS緩沖溶液透析3-5d，分裝保存 于-20°C的冰箱中。
[0022] 另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)于本發(fā)明第一方面的免疫原產(chǎn)生的抗體，這些抗體能夠 至少與一個(gè)仙茅苷結(jié)構(gòu)上的表位結(jié)合，優(yōu)選與完整的仙茅苷結(jié)構(gòu)表位相結(jié)合，該抗體是多 克隆的，或是單克隆的，優(yōu)選為單克隆抗體，且具有對(duì)仙茅苷的特異性的抗體。
[0023] 免疫檢測(cè)時(shí)要將該抗體固定在支撐底物上。優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括將所述血 清抗體固定到支撐底物上，優(yōu)選固體支持物，最優(yōu)選聚苯乙烯固體支持物。
[0024] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備抗體的方法，該方法包含通過重復(fù)給予根據(jù)本發(fā)明的 仙茅苷的免疫原免疫動(dòng)物，優(yōu)選脊稚動(dòng)物，最優(yōu)選哺乳動(dòng)物，并收集從免疫動(dòng)物得到的血清 的步驟。
[0025] 另一方面，本發(fā)明包括在試樣中檢測(cè)或測(cè)定仙茅苷的方法，該方法包括用本發(fā)明 的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物接觸試樣；檢測(cè)或測(cè)定結(jié)合的綴合物的數(shù) 量；并且從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷試樣中仙茅苷的的存在或數(shù)量。
[0026] 另一方面，本發(fā)明還描述了如何將針對(duì)這種免疫原產(chǎn)生的抗體用于開發(fā)可用來檢 測(cè)和測(cè)定仙茅苷的存在的通用分析方法和相應(yīng)的試劑盒。該試劑盒包括用本發(fā)明的偶合物 或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合物，同時(shí)該試劑盒可以任意地包括應(yīng)用所述綴合物和 所述抗體在試樣中檢測(cè)或測(cè)定仙茅苷的指導(dǎo)。優(yōu)選地，試樣是溶液，如生物流體。更優(yōu)選地， 試樣是血清或尿。在本發(fā)明的方法和試劑盒中，首選各自不同的交聯(lián)劑（免疫原的和偶合 物的）。
[0027] 另一方面，本發(fā)明包括使用本發(fā)明的偶合物或其混合物和本發(fā)明的抗體或其混合 物在試驗(yàn)試樣如生物流體中檢測(cè)或測(cè)定仙茅苷。
[0028] 為了產(chǎn)生多克隆抗血清，將免疫原與Freund佐劑混合，并且將混合物注射入宿主 動(dòng)物體內(nèi)，如兔、羊、鼠、天竺鼠或馬。進(jìn)一步注射（加強(qiáng)）并取血清試樣評(píng)價(jià)抗體滴度。達(dá) 到最佳滴度時(shí)，隨后將宿主動(dòng)物放血得到適當(dāng)體積的特異性的抗血清。要求的抗體純化水 平視計(jì)劃的應(yīng)用而定。對(duì)于許多目的，根本不需要純化，但是，在其它情況下，例如抗體固定 在固體載體上，純化步驟能夠除去不想要的物質(zhì)和除去非特異性的結(jié)合。本發(fā)明特異性抗 體作為試劑在免疫試驗(yàn)中用于測(cè)定或檢測(cè)生物流體中的仙茅苷的含量是需要純化的。
[0029] 單克隆抗體的制備本發(fā)明所述單克隆抗體是指獲自基本上同源的抗體群的抗 體，即組成該群體的抗體個(gè)體都相同，除了可能存在少量可能的自發(fā)突變。
[0030] 本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，本 發(fā)明完全抗原，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)單克隆抗體的產(chǎn)生。對(duì)于單克隆抗體，可利用雜交 瘤技術(shù)來制備或可用重組DNA法制備。骨髓瘤細(xì)胞可選鼠類的骨髓瘤細(xì)胞系，包括衍生自 M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細(xì)胞系以及SP-2、ΝΖ0或X63-Ag8-653細(xì)胞，以及人 骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細(xì)胞系。
[0031] 對(duì)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于其中的培養(yǎng)基進(jìn)行分析以檢測(cè)具有所需特異性的單克隆抗 體的產(chǎn)生，如通過體外結(jié)合分析，例如酶聯(lián)免疫吸附分析（