一種腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水不溶性葡聚糖（Insoluble glucan，IG)是一類(lèi)不溶于水溶液、以葡萄糖為單一 組分聚合而成的一種糖類(lèi)多聚物，這類(lèi)理化性質(zhì)特殊的碳水化合物不但來(lái)源廣泛，在植物、 真菌以及細(xì)菌的代謝產(chǎn)物中均有報(bào)道，而且種類(lèi)繁多。目前報(bào)道較多的IG有dextran、 curdlan和cellulose三種，從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)看，已報(bào)道的這些IG的分支僅由α-(1，2)、α-(1，3) 或α_(1，4)糖苷鍵中的一種將支鏈與主鏈連接起來(lái)，極少涉及2種或以上糖苷鍵的分支結(jié) 構(gòu)。因此，新構(gòu)型IG的篩選與發(fā)現(xiàn)不僅為IG家族增添了新的成員，而且極大地推動(dòng)了IG結(jié)構(gòu) 有關(guān)研究的前沿領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是當(dāng)前水不溶性多糖來(lái)源狹隘，支鏈與主鏈的連接結(jié) 構(gòu)糖苷鍵類(lèi)型單一，制備方法繁瑣，用于制備的菌種為有害菌等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種腸 膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制備方法。
[0004] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)保藏號(hào)為CGMCC No. 10064的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD3749在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液制備可得具有特殊結(jié)構(gòu)的水 不溶性胞外多糖，由此發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為:一種腸膜明串珠菌的水不 溶性胞外多糖，所述的水不溶性胞外多糖為一種主鏈由α_(1，6)糖苷鍵連接而成，支鏈由α-(1，3)和€ 1-(1，4)糖苷鍵連接而成的葡聚糖，其中，糖苷鍵€[-(1，6):€[-(1，3):€ [-(1，4)的摩爾 比例為 1:0.2~0.3:0.3~0.4。
[0006] 所述水不溶性胞外多糖為一種同時(shí)擁有α-(1，3)和α-(1，4)糖苷鍵的水不溶性葡 聚糖，較佳地呈白色粉末狀。
[0007] 所述的水不溶性胞外多糖較佳地由保藏編號(hào)為CGMCC No. 10064的腸膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)BD3749產(chǎn)生。
[0008] 如前所述腸膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖可以由下述制備方法制備而得。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之二為:一種腸膜明串珠菌的水不 溶性胞外多糖的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0010] 1)將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesentero ides) BD3749接種于培養(yǎng)基中，發(fā)酵 培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；
[0011] 2)將步驟1)所得發(fā)酵液冷凍干燥后，取凍干粉末用堿液浸提，取上清，調(diào)節(jié)pH至7， 取沉淀，冷凍干燥即得。
[0012] 本發(fā)明步驟1)為：將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD3749接種于 培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液。
[0013] 本發(fā)明制備方法中所述的腸膜明串珠菌BD3749已于2014年11月26日保藏在中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3號(hào)，郵編：100101。該菌株的建議的分類(lèi)命名為 ：腸膜明串珠菌1^11(：〇11〇^〇(3 mesenteroides，該菌株的保藏編號(hào)為:CGMCC如.10064，所保藏的培養(yǎng)物名稱為403749。 [0014]本發(fā)明所述腸膜明串珠菌BD3749的制備方法為常規(guī)的，較佳地還包括該腸膜明串 珠菌BD3749活化獲得腸膜明串珠菌種子的步驟。所述腸膜明串珠菌種子為常規(guī)方法獲得， 較佳地為包括以下步驟的方法:將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)BD374^9 凍干粉用少量無(wú)菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于含5%蔗糖的M17固體培養(yǎng)基(購(gòu)買(mǎi) 自0X0ID，英國(guó)），30°C好氧培養(yǎng)48h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入10mL含5%蔗糖的M17液 體培養(yǎng)基（購(gòu)買(mǎi)自0X0ID，英國(guó)），運(yùn)用渦旋振蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，30°C， 180rpm振蕩培養(yǎng)24h取出，以2%(v/v)接種量接種于含5%蔗糖的M17液體培養(yǎng)基(購(gòu)買(mǎi)自 0X0ID，英國(guó)），30°C，180rpm振蕩培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)物15，OOOrpm離心10分鐘，棄去上清，菌 體用無(wú)菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子(亦稱腸 膜明串珠菌種子液）。所述腸膜明串珠菌BD3749的凍干粉由以下方法制備:挑取2個(gè)菌落，接 種于300mL的10 % (w/w)的脫脂乳溶液里30°C培養(yǎng)4h，-80°C預(yù)凍過(guò)夜，_20°C冷凍干燥。
[0015] 其中，所述的培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)的培養(yǎng)基，只要能培養(yǎng)腸膜明串珠菌即可，較佳 地為合成培養(yǎng)基，所述合成培養(yǎng)基包括以下組分：蛋白胨1 %、酵母提取物0.5%、 K2HP〇4〇 · 5%、CaCl20 · 034%和蔗糖5~30%，蔗糖的含量較佳地為10~20%，更佳地為10%， 余量為水，所述百分比為質(zhì)量百分比。所述合成培養(yǎng)基的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方 法。所述培養(yǎng)基的pH較佳地為5~8，更佳地為7。
[0016] 其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)方法，所述腸膜明串珠菌的接種量較佳 地為1~5%，更佳地為2~4%，最佳地為3%，所述百分比為體積百分比。所述的發(fā)酵培養(yǎng)較 佳地為振蕩培養(yǎng)，所述振蕩培養(yǎng)為常規(guī)的，振蕩速度較佳地為100~300rpm，更佳地為150~ 250rpm，最佳地為200rpm。所述的發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵溫度較佳地為15~37°C，更佳地為25°C~ 33°C，最佳地為30°C，發(fā)酵時(shí)間較佳地為24~96小時(shí)，更佳地為48~84小時(shí)，最佳地為72小 時(shí)。
[0017] 本發(fā)明步驟2)為:將步驟1)所得發(fā)酵液冷凍干燥后，取凍干粉末用堿液浸提，取上 清，調(diào)節(jié)pH至7,取沉淀，冷凍干燥即得。其中，所述冷凍干燥為本領(lǐng)域常規(guī)的凍干（即冷凍干 燥)技術(shù)，只要達(dá)到去除水分，獲得固形物的目的即可。所述堿液為常規(guī)的，較佳地為NaOH溶 液，所述NaOH溶液的濃度為1~5M，較佳地為2~4M，更佳地為3M。所述浸提為常規(guī)的，所述浸 提時(shí)凍干粉末與堿液的比例為1 g: lmL~1 g: 5mL，較佳地為1 g: 2mL~1 g: 4mL，更佳地為1 g: 3mL。所述上清為常規(guī)方法取得，較佳地為離心，所述離心為常規(guī)的，離心的速度較佳地為8， 000~15,000g，更佳地為10,000~12,00(^，離心的時(shí)間較佳地為5~15分鐘，更佳地為8~ 12分鐘。所述pH使用常規(guī)方法調(diào)節(jié)，較佳地為用酸液調(diào)節(jié)，所述酸液為常規(guī)的，較佳地為HC1 溶液，所述HC1溶液濃度為1~3M，較佳地為1.5~2.5M，更佳地為2M。
[0018] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0019] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0020] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0021] 1、本發(fā)明解決了當(dāng)前水不溶性多糖(尤其是水不溶性葡聚糖)來(lái)源狹隘的現(xiàn)狀，為 水不溶性多糖的來(lái)源提供了另一種的選擇。
[0022] 2、采用本發(fā)明制備的水不溶性胞外多糖具有罕見(jiàn)的兩種支鏈糖苷鍵并存的形態(tài)， 是一種結(jié)構(gòu)新穎的多糖，根據(jù)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜的多糖功能也相對(duì)較多的理論，因此，具有一定的 開(kāi)發(fā)意義。
[0023] 3、常規(guī)多糖的制備步驟中往往涉及了去蛋白的步驟(如SAVAGE法去蛋白），但本發(fā) 明制備方法中發(fā)酵液不調(diào)節(jié)pH直接冷凍干燥，酸性發(fā)酵液被逐步凍干失水時(shí)，pH不斷下降， 造成局部過(guò)酸，導(dǎo)致發(fā)酵液中的游離蛋白迅速變性，這部分蛋白在堿液浸提時(shí)被離心除去， 從而達(dá)到了去蛋白的目的。
[0024] 4、腸膜明串珠菌屬于乳酸菌范疇，所以與其他來(lái)源菌株(如芽孢菌、產(chǎn)氣菌、霉菌 等)產(chǎn)生的不溶性多糖相比，來(lái)自腸膜明串珠菌的胞外多糖具有更高的食品安全性。本發(fā)明 制備所得的胞外多糖提取物可以作為功能性添加劑替代其他來(lái)源的水不溶性多糖應(yīng)用于 食品、制藥和相關(guān)領(lǐng)域中，其應(yīng)用前景十分廣闊。
[0025] 生物材料保藏信息
[0026]本發(fā)明的腸膜明串珠菌BD3749，已于2014年11月26日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏 管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué) 院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號(hào)為:CGMCC No. 10064,培養(yǎng)物名稱是BD3749,分類(lèi) 命名是腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides〇
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1顯示腸膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖的單糖組成測(cè)定結(jié)果。
[0028]圖2顯示腸膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖