一株銅綠假單胞菌vih2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物，具體地說涉及一株銅綠假單胞菌VIH2及其在通過VI型分泌系統(tǒng)拮抗茄科勞爾氏菌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]青枯病由前科勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起，是一種嚴(yán)重危害農(nóng)作物以及水果蔬菜品質(zhì)和產(chǎn)量的植物病害。目前對于茄科勞爾氏菌的防治主要有一農(nóng)藥為主的化學(xué)防治和以產(chǎn)抗菌類化學(xué)物質(zhì)的拮抗菌為主的生物防治。然而，施用農(nóng)藥嚴(yán)重破壞土壤結(jié)構(gòu)，危害人類健康;抗菌類物質(zhì)是次生代謝產(chǎn)物，只有在特定的培養(yǎng)條件下才會產(chǎn)生，且其容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性失去作用。
[0003]革蘭氏陰性菌可以利用自身的分泌系統(tǒng)向胞外分泌效應(yīng)蛋白，與其他種屬的微生物相互作用，從而使自身獲得競爭優(yōu)勢?，F(xiàn)在越來越多的人意識到食品安全和環(huán)境保護(hù)的重要性，效應(yīng)蛋白因其分泌不需要特定的培養(yǎng)條件且不易使病原菌產(chǎn)生抗藥性而被認(rèn)為是一種具有潛力的控制病原菌的方式。VI型分泌系統(tǒng)(type VI secret1n system，T6SS)是一種作用于原核生物的接觸依賴型的分泌系統(tǒng)，具有抑制其他種屬細(xì)菌繁殖的作用。
[0004]本實(shí)驗(yàn)從南京蔬菜所番茄根際土中篩選出一株銅綠假單胞菌VIH2，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VIH2能夠利用體內(nèi)的VI分泌系統(tǒng)，通過接觸的方式抑制茄科勞爾氏菌的生長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株銅綠假單胞菌VIH2，該菌能夠利用體內(nèi)的VI分泌系統(tǒng)，通過接觸的方式抑制茄科勞爾氏菌的生長。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供上述銅綠假單胞菌VIH2在防治由茄科勞爾氏菌引起的番茄青枯病中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]本發(fā)明的措抗菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa VIH2)，于2014年04月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所;分類名為假單胞菌(Pseudomonas sp.)，保藏號CGMCC N0.9075ο
[0009]所述銅綠假單胞菌VIH2菌落較小為淡黃色，表面濕潤，不透明，菌體細(xì)長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列，不產(chǎn)芽孢。
[0010]所述銅綠假單胞菌VIH2的生理生化特性是:革蘭氏陰性，兼性需氧，化能異養(yǎng)，淀粉水解陰性，明膠水解陽性，檸檬酸鹽利用陽性。
[0011]本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌VIH2培養(yǎng)時使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素;使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘露醇、麥芽糖、葡萄糖;使用的無機(jī)組分包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水和硫酸亞鐵。本發(fā)明的銅綠假單胞菌VIH2發(fā)酵可在30°C，pH7.0的環(huán)境下進(jìn)行。
[0012]本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌VIH2能夠通過接觸殺死茄科勞爾氏菌，二者在ΝΑ平板上接觸培養(yǎng)24小時后，茄科勞爾氏菌的生物量下降5個數(shù)量級以上。如果將VIH2菌株的VI型分泌系統(tǒng)的調(diào)控基因ΡΡΚΑ破壞掉，那么，在接觸培養(yǎng)24小時后，茄科勞爾氏菌的生物量下降不足2個數(shù)量級。這個實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了該銅綠假單胞菌VIH2能夠利用體內(nèi)的VI分泌系統(tǒng)，通過接觸的方式抑制茄科勞爾氏菌的生長。
[0013]本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌能夠有效抑制茄科勞爾氏菌在番茄根系的定殖，但是如果將ΡΡΚΑ基因破壞掉，銅綠假單胞菌抑制茄科勞爾氏菌定殖的效果不明顯。
[0014]本實(shí)驗(yàn)所述的銅綠假單胞菌在土壤中也可以有效抑制茄科勞爾氏菌的生長，但是如果將ΡΡΚΑ基因破壞掉，銅綠假單胞菌在土壤中不再具有抑制茄科勞爾氏菌的能力。
[0015]上述的銅綠假單胞菌VIH2在利用體內(nèi)的VI分泌系統(tǒng)，通過接觸的方式抑制茄科勞爾氏菌生長中的應(yīng)用。
[0016]上述的銅綠假單胞菌VIH2在防治由茄科勞爾氏菌引起的番茄青枯病中的應(yīng)用。
[0017]上述的銅綠假單胞菌VIH2在制備防治茄科勞爾氏菌的菌肥中的應(yīng)用。
[0018]本發(fā)明的有益效果:
[0019]本發(fā)明的銅綠假單胞菌VIH2能夠利用體內(nèi)的VI分泌系統(tǒng)，通過接觸的方式抑制茄科勞爾氏菌的生長，降低由茄科勞爾氏菌引起的番茄青枯病的發(fā)病率。
【附圖說明】
:
[0020]圖1為本發(fā)明菌株VIH2的菌落圖
[0021]圖2為本發(fā)明菌株VIH2對茄科勞爾氏菌的接觸與不接觸抑制試驗(yàn)結(jié)果
[0022]圖3為VIH2菌株與VIH2ΛρρΚΑ菌株對茄科勞爾氏菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果
[0023]圖4為VIH2/VIH2ΛρρΚΑ在土壤中對茄科勞爾氏菌的拮抗效果
【具體實(shí)施方式】
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[0024]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明更進(jìn)一步的說明。
[0025]首先準(zhǔn)備以下2種培養(yǎng)基。
[0026]1^培養(yǎng)基:胰蛋白胨1(^，酵母粉58，氯化鈉1(^，瓊脂粉158，蒸餾水10001111，？!17.0，121°C滅菌，20min。
[0027]LB液體培養(yǎng)基:不加瓊脂粉，其他條件同上。
[0028]NA培養(yǎng)基:胰蛋白胨5g，酵母粉0.5g，牛肉膏3g，葡萄糖10g，瓊脂粉15g，蒸餾水1000ml ,pH 7.0，115°C滅菌，30min。
[0029]ΝΑ液體培養(yǎng)基:不加瓊脂粉，其他條件同上。
[0030]將從南京蔬菜所取的番茄根際土挑根過篩后稱取10g置于盛有90ml滅菌水的250ml的三角瓶中，在搖床中，30°C，150r.π?η—1振蕩20min，靜置lOmin，得到土壤懸浮液。該土壤懸浮液中含有若干種拮抗菌，采用稀釋法稀釋后涂于LB培養(yǎng)基，于30°C恒溫箱中培養(yǎng)24h后，挑取不同類型典型單個菌落，經(jīng)平板純化后，-70°C甘油保藏待用。
[0031]實(shí)施例1接觸抑制試驗(yàn)
[0032]通過平板對峙的方式篩選出接觸依賴型的拮抗菌。
[0033]為了方便觀察效果，采用帶有紅色熒光標(biāo)記的茄科勞爾氏菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0034]首先將茄科勞爾氏菌接種到含有30ppm慶大霉素的NA液體試管中，180r/min，30°C培養(yǎng)過夜。然后取lml菌液12000rpm離心2min收集菌體，用lml無菌水重懸3次。
[0035]實(shí)驗(yàn)1:
[0036]取5yL重懸后的菌液接種到不含任何抗生素的LB平板上，形成茄科勞爾氏菌的菌斑，在菌斑旁邊用滅過菌的牙簽接種分離純化后的菌株，觀察對峙結(jié)果。
[0037]實(shí)驗(yàn)2:
[0038]取5yL重懸后的菌液涂布到不含任何抗生素的LB平板上，該平板中央放置0.22μηι的無菌濾膜，在濾膜另一側(cè)用滅過菌的牙簽接種分離純化后的菌株，觀察對峙結(jié)果。
[0039]由于0.22μπι的無菌濾膜可以使小分子化合物通過卻不能讓細(xì)菌通過，所以接觸依賴型的拮抗菌在實(shí)驗(yàn)1的條件下具有拮抗作用而在實(shí)驗(yàn)2的條件下不再具備拮抗茄科勞爾氏菌的作用。
[0040]通過以上方法篩選出一株接觸依賴型的拮抗菌，如圖1所示，該菌株形成的菌落為淡黃色，表面濕潤，不透明，菌體細(xì)長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列，不產(chǎn)芽孢，命名為VIH2。該菌株在ΝΑ平板上與茄科勞爾氏菌接觸培養(yǎng)24小時后，茄科勞爾氏菌的生物量下降5個數(shù)量級以上(圖2)，表示拮抗作用的發(fā)生依賴VIH2與茄科勞爾氏菌的接觸。
[0041 ]將上述方法篩選分離出的菌株，經(jīng)過測序，根據(jù)16SrDNA的測序結(jié)果，在http: //www.ncb1.nlm.nih.gov在線查詢分析，利用Blast軟件在GenBank中與其它的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，選擇相近的序列與VIH2的序列用MEGA vers1n 3軟件構(gòu)建VIH2的16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹，同時結(jié)合b1 log的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒定為銅綠假單胞菌(Rais toniasolanacearum)，同源性為99%。將該菌株于2014年04月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC N0.9075。
[0042]實(shí)施例2
[0043]好氧性試驗(yàn)
[0044]把滅過菌的LB培養(yǎng)基倒入3個已滅菌的試管中，大約在2/3處，在無菌操作臺上，用接種針挑取斜面培養(yǎng)的所述菌，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中(必須穿刺到管底)。301培養(yǎng)，分別在3天至7天觀察結(jié)果。在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿穿刺線生長者為厭氧菌或兼性需氧菌。試驗(yàn)結(jié)果為兼性需氧。
[0045]淀粉水解試