突變酶的制作方法
【專利說明】
[0001 ]本申請是申請日為2 0 0 8年1 0月8日的題為"突變酶"的中國專利申請 No .200880119582.8 的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及具有增強(qiáng)性能的突變酶。
【背景技術(shù)】
[0003] 生物酶催化劑，如P450bm-3酶，發(fā)現(xiàn)越來越多地用于從精細(xì)化學(xué)品、中間體、藥品和 藥物代謝物的合成到有機(jī)化學(xué)污染物和污物的降解的各種工業(yè)應(yīng)用中。蛋白質(zhì)工程，采用 定向進(jìn)化(directed evolution)或定點(diǎn)突變，可以用于分離已知酶的變異體，這可以對它 們的催化活性產(chǎn)生新的契機(jī)和應(yīng)用。
[0004] 巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) (1)的P45〇bm-3屬于細(xì)胞色素 P450酶的超家 族(或超族，superfamily)。在各種基因序列數(shù)據(jù)庫中存在超過7,700個編碼P450酶的基因。 P450酶的命名法也已經(jīng)系統(tǒng)化。酶的超家族稱為CYP，之后是酶家族的編號（因此，為CYP1、 CYP51、CYP102等），其被分成通過字母表示的子族（因此，為CYP1A、CYP101B等），并且每一子 族成員由數(shù)字標(biāo)識（因此，為CYP1A1、CYP3A4、CYP101D3等）。編碼CYP酶的基因由斜體表示， 例如CYP101A1基因。P450bm-3已被標(biāo)識為CYP102A1，即，它是CYP102家族的第一成員。自此， CYP102A1的系統(tǒng)命名將用于P450bm- 3。
[0005] CYP102A1(1)是用于生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用的受關(guān)注的酶，因?yàn)槠涫谴呋献越o自足的。與 其他P450酶不一樣，其中P450單加氧酶和電子轉(zhuǎn)移輔助因子蛋白是獨(dú)立的部分 (entities)，CYP102A1具有融合至二弗拉芬(diflavin)電子轉(zhuǎn)移還原酶域的血紅素單加氧 酶域，其在單個多肽中同時含有FAD和FMN輔基。CYP102A1的天然底物被認(rèn)為是直鏈或支鏈 的中鏈脂肪酸（1，2) XYP102A1血紅素域的晶體結(jié)構(gòu)在1993年（3)就可獲得，其中揭示了活 性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)并且存在底物進(jìn)入通道(或底物接近通道，substrate access channel)。四年 之后公布的具有結(jié)合底物的晶體結(jié)構(gòu)，指出對于F87-旦底物結(jié)合后側(cè)鏈構(gòu)象的變化(4)。
[0006] 對CYP102A1的蛋白質(zhì)工程已經(jīng)進(jìn)行了綜述(5~7)。早期的研究集中在活性位點(diǎn)殘 基F87,其中F87V、F87A、F87Y和F87G突變已經(jīng)顯示出對脂肪酸氧化的活性和選擇性具有不 同的影響(8~11) A87上的突變已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有利于各種底物的氧化(7)。在底物進(jìn)入通道入口 處的殘基如F42、R47和Y51也被標(biāo)靶。雖然F42A突變降低了酶活性（10)，但是中和或逆轉(zhuǎn)在 47位置處的電荷改變了底物的特異性(8，12)，正如疏水性取代￥5^-樣。冊0031273公開了 突變的R47L/Y51F偶聯(lián)體(或結(jié)合體，couplet)用來促進(jìn)疏水性有機(jī)分子如聚芳香烴和類萜 烴的進(jìn)入、結(jié)合和氧化。該偶聯(lián)體也與F87A、I263A、A264G和M354A突變組合以提供增強(qiáng)的底 物氧化的活性和/或產(chǎn)物選擇性（13，14) A47L/Y51F組合，以及在其自身上的R47L和Y51F突 變，現(xiàn)在通常用于CYP102A1工程(15~19)。
[0007] 除了突變位點(diǎn)的合理選擇之外，篩選技術(shù)已經(jīng)用于識別對活性和選擇性具有期望 影響的其他突變和突變位點(diǎn)。隨機(jī)或位點(diǎn)飽和誘變早在1997年就應(yīng)用于CYP102A1 (20)。 N020020380公開了使用經(jīng)由吲哚氧化生成靛藍(lán)作為發(fā)現(xiàn)具有新的活性的CYP102A1突變的 篩選方法。飽和誘變應(yīng)用于許多可能影響底物結(jié)合的殘基，而突變體A74G/F87V/L188Q據(jù)報 道相比于野生型能以增強(qiáng)的活性和改變的選擇性氧化很寬范圍的有機(jī)分子（21~25)。 AT342351T公開了經(jīng)由ω-對硝基苯氧基-羧酸氧化而采用光譜檢測到對硝基苯酚的生成， 在一組隨機(jī)誘變實(shí)驗(yàn)中作為篩選程序。突變V26T、R47F、S72G、A74G、F87A&V、L188A，G，Ν，Κ， 0，尺，5嫌、]\〇541'都已公開（26,27)。
[0008]對硝基苯酸篩選方法通過采用對硝基苯氧基辛燒作為替代底物（surrogate substrate)而得以擴(kuò)展。W02002083868、EP1470219和 US2005202419(隨后在 W02005017116、 EP1660646 和 US2005037411 中校正）公開 了突變 L52I、I58V、F87A、H100R、S106R、F107L、 A135S、M145A&V、A184V、N239H、S274T、L324I、V340M、I366V、K434E、E442K、V446I。
[0009] W02003008563和US2003100744公開了采用相同方法的更多輪隨機(jī)誘變、基因重組 (gene shuffling)和篩選的結(jié)果，并報道了突變M30I、E64A、V78A、F87A，D，G，H，I，K，N，R，V& W、H138Y、F162S、H171Q、T175I、V178I、A184V、N186D、D217V、I220T、K224I、S226I、D232G、 T235A、H236Q、E252G、R255S、I258T、I259V、T268Q、A290V、A295T、L353V，D370Q，E380G、 G396M、T411A、M416L。
[0010] W02005017105、US2005059128和EP1639091公開了相同方法的使用并報道了突變 R47C、L75I&W、V78A，F(xiàn)&T、A82L，F(xiàn)，G，I，S&T、F87I，L&V、T88C、K94I、P142S、T175I、A184V、 F205C、S226R、H236Q、E252G、R255S、T260，L，N&S、A290V、A328V&M、L353V。
[0011] 隨后，W02006105082 公開 了突變 R47C、V78F、A82S、K94I、P141S、T175I、A184V、 F205C、S226R、H236Q、E252G、R255S、A290V、A291V、A328F、L353V。
[0012] 這些通過隨機(jī)誘變產(chǎn)生的系列突變體顯示出對于從乙烷到中鏈烷烴的烷烴氧化 的增強(qiáng)的活性(28~30)。也存在選擇性變化，尤其是在定向進(jìn)化變異體與通過定點(diǎn)誘變引 入到活性位點(diǎn)的突變組合時，例如，在辛烷氧化中，其中突變將氧化位點(diǎn)向末端碳轉(zhuǎn)移 (31)，在末端烯烴的選擇性環(huán)氧化中（32)，以及對映選擇性在環(huán)戊烷羧酸衍生物的氧化中 (33)。值得注意的是，通過使定向進(jìn)化與合理的重新設(shè)計進(jìn)行組合經(jīng)?？梢垣@得更好的結(jié) 果。
[0013] CYP102A3 是與 CYP102A1屬于相同子族（sub-family)的 P450 酶。CYP102A3 的隨機(jī)誘 變，接著烷烴氧化并在對末端醇特異性的醇脫氫酶存在的情況下監(jiān)控NADH的形成，產(chǎn)生了 由辛烷氧化生成50%的1-辛醇的突變。這是迄今為止通過設(shè)計的CYP102族P450酶所觀察到 的直鏈烷烴的末端C-H鍵氧化的最高比例(34)。
[0014] 仍繼續(xù)需要分離工業(yè)上有用的酶如CYP102A1酶的另外的突變，以進(jìn)一步理解結(jié)構(gòu) 變化對它們的催化機(jī)理的影響，改進(jìn)它們的催化轉(zhuǎn)化(catalytic turnover)，并擴(kuò)大其底 物和/或產(chǎn)物的范圍。通常，進(jìn)行P450酶如CYP102A1的設(shè)計以增強(qiáng)酶活性，其中控制產(chǎn)物選 擇性和底物特異性是第二重要的目標(biāo)?？蓪⑦x擇性控制結(jié)合至增強(qiáng)的單加氧酶活性的突變 和突變位點(diǎn)是顯著缺乏的，以致化合物的酶轉(zhuǎn)化可以是較快的但是沒有足夠的選擇性，或 雖有一定的選擇性但反應(yīng)很慢，或期望的產(chǎn)物并未形成。對于可以提供具有增強(qiáng)的活性和/ 或期望的選擇性的突變體的篩選方法也存在需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，CYP102A1特異性位置的取代突變在增強(qiáng)單加氧酶活 性方面具有期望的作用，并且也提供了改變的選擇性。這些突變位點(diǎn)通過使用提供增強(qiáng)的 活性和增強(qiáng)/改變的選擇性選擇的新型篩選方法來識別。
[0016] 本發(fā)明提供了一種突變CYP102A1酶，其具有增強(qiáng)的單加氧酶活性和/或改變的選 擇性，并含有在 CYP102A1 的位置 117、131、191、215、276、307、330、377、401、403、425 中的一 個或多個處的取代。另外還提供了一種用于氧化作為有機(jī)化合物的底物的方法，該方法包 括用本發(fā)明的突變CYP102A1酶來氧化所述有機(jī)化合物。
[0017] 所要求的取代（替代，substitution)構(gòu)成相同的本發(fā)明構(gòu)思的一部分，因?yàn)樗鼈?共同具備增強(qiáng)單加氧酶活性的效應(yīng)和/或改變CYP102A1的選擇性。在位置330、401和403的 取代也經(jīng)由如下所概述的共同結(jié)構(gòu)和功能機(jī)制發(fā)揮它們的作用。
[0018] SEQ ID N0:1 是CYP102A1 的序列。
【附圖說明】
[0019] 圖1:相關(guān)殘基在CYP102A1(P450bm-3)中的定位。Palm表示該酶的脂肪酸底物。
[0020]圖2:在野生型CYP102A1和A330P突變體的底物進(jìn)入通道中的關(guān)鍵殘基和活性位點(diǎn) 的比較，突出表明了由A330P突變產(chǎn)生的P329和A328處的結(jié)構(gòu)攝動（structural perturbations)〇
【具體實(shí)施方式】
[0021 ] 本發(fā)明可以適用于CYP102A1的天然和人工同源物(或同系物，homologues)，例如， 其包括與CYP102A1具有至少40%的氨基酸序列同一性的序列。這樣的同源物典型地包括對 應(yīng)于（即與之具有同源性或相同于)CYP102A1的血紅素單加氧酶域的氨基酸序列（由氨基酸 位置1~480表示）。
[0022] 本發(fā)明的酶包括與SEQ ID N0:1(CYP102A1的序列）具有至少40%同一性的序列 (或由其構(gòu)成）。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該序列在至少20,優(yōu)選至少30,例如至少40、60、100、 200、300、400或更多個鄰近氨基酸內(nèi)，或甚至在同源物的整個序列內(nèi)與其可能具有至少 55%、65%、80%或90%，并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%的同源性。在一個實(shí)施方式中， 本發(fā)明的酶在與CYP102A1的氨基酸殘基1~480相比時具有任何指定的百分比同源性。鄰近 氨基酸可以包括活性位點(diǎn)。該同源性可以可替換地并不在鄰近氨基酸內(nèi)而是僅僅在活性位 點(diǎn)的氨基酸內(nèi)進(jìn)行測定。因此，同源性基于氨基酸的同一性典型地至少40 %同源于 CYP102A1。本發(fā)明的酶可以與CYP102A1序列具有一定百分比同一性，這與以上提及的任何 序列長度內(nèi)任何具體百分比同源性值（即，其可以具有至少40%、55%、80%或90%以及更 優(yōu)選至少95%、97%或99%的同一性)相同。
[0023]同源序列可以表示CYP102A1序列的突變部分和/或可以以本發(fā)明酶的全長融合多 肽的形式存在。
[0024]本文中所提及的任何同源蛋白（即，描述為與另一蛋白同源)典型地至少40%同源 于相關(guān)的蛋白。同源性可以采用已知的方法進(jìn)行測定。例如，UWGCG軟件包提供了可以用于 計算同源性的BESTFIT程序（例如，以其缺省設(shè)置進(jìn)行使用KDevereux et al(1984) Nucleic Acids Research 12,387_395)。
[0025] PILEUP和BLAST算法可以用于計算同源性或比對序列（典型地按照其缺省設(shè)置）， 例如在Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300;Altschul，S，F(xiàn) et al(1990)J Mol Biol 215:403-10中所描述的。
[0026] 用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可以通過國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi .nhn.nih.gov/)公開獲得。i亥算法首 先涉及通過在與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時匹配或滿足一些正值閾值評分T的查詢 序列中識別長度W的短字來識別高評分序列對(HSPhT稱為鄰近字評分閾值(Altschul et al，supra)。這些初始的鄰近字命中（word hits)作為用于初始搜索以找到含有它們的HSP 的種子(seeds)。字命中在沿著直至能夠增加累積比對評分的每一序列的兩個方向上延伸。 當(dāng)累積比對評分從其最大達(dá)到值下降量X;由于一個或多個負(fù)評分殘基比對的累積使累積 評分變成零或更低；或任一序列的末端到達(dá)時，對在每一方向上字命中的延伸就停止。 BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLAST程序使用11的字長(W)，50的 BL0SUM62評分矩陣（參見Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89: 10915-10919)比對(B)，10的期望值(E)，M=5，N=4和雙鏈對照作為缺省值。
[0027] BLAST算法進(jìn)行兩序列之間類似性的統(tǒng)計分析;參見例如，Karlin and Altschul (1993)Proc · Natl · Acad · Sci · USA 90:5873-5787。通過BLAST算法提供的一種類似性度量是 最小和概率(P(N))，其提供了一個概率指示，通過該概率指示兩個核苷酸或氨基酸序列之 間的匹配就會偶然出現(xiàn)。例如，如果在第一序列與第二序列的比較中最小和概率低于約1， 優(yōu)選低于約0.1，更優(yōu)選低于約0.01，并且最優(yōu)選低于約0.001，則該序列被認(rèn)為類似于另一 序列。
[0028] 典型地，當(dāng)比較所有蛋白或任何以上提及的鄰近氨基酸（contiguous amino acids)的長度時，同源蛋白不同于相關(guān)蛋白至少、或少于2、5、10、20、40、50或60個突變(其 每一個都可以是取代、插入或缺失）。
[0029]本發(fā)明的CYP102A1酶的酶活性典型地在體外采用本文中所提及的任何底物或條 件進(jìn)行測定，并作為NADPH氧化速率，產(chǎn)物生成速率和結(jié)合效率(coupling efficiency)給 出。速率是轉(zhuǎn)化頻率并以（nmol NADPH)(nmol CYP1 02A1)-Hmin)-1 或（nmol產(chǎn)物）（nmol CYP1 (^Α?ΓΗπ?ηΓ1給出。結(jié)合效率是用于產(chǎn)物生成所消耗的NADPH的百分?jǐn)?shù)，即，理論最 大效率的百分?jǐn)?shù)。本發(fā)明的CYP102A1酶(例如，當(dāng)用于本發(fā)明的方法中時)可以典型地具有 至少1 %，如至少2%、4%、6%、10%、20%、40%、80%或更大的結(jié)合效率。CYP102A1酶（例 如，當(dāng)用于本發(fā)明的方法中時)典型地具有至少SmirT 1，如至少4、10、15、20、25、50、100、200、 300、500、700、1000、200011^11_ 1或更大的產(chǎn)物生成速率。在形成多于一種產(chǎn)物(這是一種常見 的情況）的情況下，產(chǎn)物生成速率表示形成的所有氧化產(chǎn)物的總量。在一些實(shí)施方式中，測 量特定氧化產(chǎn)物的產(chǎn)物生成速率，即，可以測量并非所有的氧化產(chǎn)物。
[0030] 本發(fā)明的突變CYP102A1酶顯示出相對于相應(yīng)的野生型CYP102A1酶的增強(qiáng)的單加 氧酶活性和/或改變的選擇性。增強(qiáng)的單加氧酶活性可以根據(jù)增加的結(jié)合效率或增加的產(chǎn) 物生成速率采用一種或多種用于氧化的底物進(jìn)行表征。增加的結(jié)合效率或增加的產(chǎn)物生成 速率可以在或可以不在被突變CYP102A1酶利用的所有底物中共享。突變CYP102A1酶典型地 表現(xiàn)出比該野生型酶的結(jié)合效率大至少10%、20%、50%、100%、500%、1000%或1500%的 結(jié)合效率。突變CYP102A1酶也可以具有比該野生型酶的產(chǎn)物生成速率大至少50%、100%、 150%、500%、1000%、2000%、5000%、10000% 的產(chǎn)物生成速率。
[0031] 應(yīng)該理解到，本發(fā)明的突變CYP102A1酶也可以顯示出相對于相應(yīng)的野生型酶和文 獻(xiàn)中所公開的突變體的其他改變的特性，使得這些效應(yīng)可以包括但也不限于增強(qiáng)的單加氧 酶活性。例如，突變酶可以顯示出改變的底物特異性，允許優(yōu)先利用特異性底物，或可以顯 示出單加氧酶活性，其中野生型酶或已知的突變體并不能氧化底物有機(jī)化合物。
[0032] 本發(fā)明的突變酶也可以顯示出改變的產(chǎn)物選擇性，其中由野生型以較小比例形成 的產(chǎn)物成為突變體的優(yōu)勢產(chǎn)物，或以較小比例或根本不由野生型形成的新產(chǎn)物成為大多數(shù) 或優(yōu)勢產(chǎn)物。下面描述突變酶和通過該突變酶實(shí)施的氧化過程的另外的改變的特性。
[0033] 突變 CYP102A1 酶在 CYP102A1 的位置 117、131、191、215、276、307、330、377、401、403 和425中的一個或多個處包括取代。典型地，它們可以在2個或更多個、3個或更多個、4個或 更多個、5個或更多個、6個或更多個以上定義的位置處包括取代。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式 中，其中在位置330處具有取代，存在小于5個其他取代，如小于3，或在一個實(shí)施方式中，其 他位置沒有被取代。
[0034]在描述CYP102A1的特異性突變的情況下，在CYP102A1的天然形式中存在的氨基酸 殘基的字母在位置之前，位置之后是突變體中的氨基酸。這些位置可以關(guān)聯(lián)于SEQ ID NO: 1 中所示的編號。為了指示出相同蛋白中的多個突變，每一突變通過斜線分開而列出。而且， 尤其優(yōu)選的突變體可以采用以下概述的內(nèi)部命名法進(jìn)行描述。
[0035] 雖然參照CYP102A1中的位置定義了突變，但是本發(fā)明也涵蓋享有與SEQ ID N0:1 至少40 %氨基酸同一性的CYP10 2A1同源物的多肽鏈中同源的或相應(yīng)位置的等價取代突變。 等價位置(equinalent position)通過參照SEQ ID N0:1的氨基酸序列進(jìn)行確定。基于序列 之間的同源性，同源或相應(yīng)位置可以通過對比CYP102A1 (SEQ ID NO: 1)的序列和同源物(或 同系物，homologue)序列來容易地推導(dǎo)。PILEUP和BLAST算法可以用于比對這些序列。在所 指的同源的或相應(yīng)的氨基酸是活性位點(diǎn)殘基的情況下，一般將處于如同本文中討論的任何 特定氨基酸的同源物活性位點(diǎn)中的類似位置。
[0036]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說眾所周知的是，P450酶超家族盡管具有高度保守的三級 結(jié)構(gòu)，但在蛋白和酶中具有低同源性的一級結(jié)構(gòu)卻是不常見的（35~37)。在基因組數(shù)據(jù)庫 中現(xiàn)在存在>6500CYP基因，而在蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank)中存在>150的結(jié)構(gòu)。迄今 確定的所有P450結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出結(jié)合針對主β鏈域包裝的富螺旋域的特性形態(tài)學(xué)，如Poulos及 其合作者首次報道的P450酶(CYP101A1)的晶體結(jié)構(gòu)中所描述的（38)。螺旋命名為A-L，而β 鏈β1-β5,其中整個形態(tài)現(xiàn)在稱為"Ρ450折疊"（38-42)。在二級結(jié)構(gòu)元件中，血紅素遠(yuǎn)側(cè)上的 Β和Β'螺旋、BC環(huán)、F和G螺旋和FG環(huán)形成底物結(jié)合袋（substrate binding pocket)。序列比 對很容易識別這些螺旋和環(huán)中的殘基，但是根據(jù)氨基酸序列和結(jié)構(gòu)排列，在這些一般框架 內(nèi)存在高度可變性，而且這也產(chǎn)生了 P450催化的多種特異性、活性和選擇性模式。
[0037] 在不同家族中的P450酶具有低至20%的同源性（氨基酸同一性）（35~37)。在 CYP102A1和結(jié)構(gòu)表征的P450酶之間比對的樣例示于表A中。直至近來，連續(xù)序列分析已經(jīng)建 議，在P450酶或域中典型的400~460中少至3個殘基是絕對保守的:血紅素鐵的鄰近半胱氨 酸配體，和在血紅素連接和結(jié)合中可能起作用的K螺旋中的EXXR基序(43)。然而，有關(guān)2006 年公開的CYP157家族的結(jié)果表明，甚至EXXR基序也不是保守的，剩下鄰近半胱氨酸作為整 個P450超家族中僅有的保守殘基。在P450超家族的系統(tǒng)分類中（44)，剛好具有40%氨基酸 同一性的酶因此而位于相同的家族中，而緊密相關(guān)的家族成員（>55%同一性)歸成子族(參 見，例如，表B)。
[0038]實(shí)際上詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)，底物特異性和產(chǎn)物選擇性在家族內(nèi)是保守的，而序列同 一性卻經(jīng)常較低。最顯著的實(shí)例是在生命王國中發(fā)現(xiàn)的固醇14α-去甲基酶的CYP51家族。這 些在角鯊烯氧化物環(huán)化之后形成的中間體的C14甲基的氧化性去甲基化作用中起到關(guān)鍵作 用。序列比對表明，整個生命王國的已知CYP51族基因之間的同源性平均為30 %，在緊密相 關(guān)的物種如哺乳動物中升高至95%，而在低級生物之間下降至23% (45)。越來越認(rèn)識到，用 于將酶分配給同一家族的40%臨界值在一些情況下可能過高，而經(jīng)常對于活性位點(diǎn)殘基觀 察到的酶活性和更高的同源性可能需要在未來被更多地考慮。
[0039]因此，典型地基于"Ρ450折疊"也可以容易地識別基于氨基酸同一性與CYP102A1至 少40%同源的同源物，而在相應(yīng)或同源位置引入等價突變的同源物序列的比對可以通過包 含在整個酶家族中共享的Ρ450折疊的α螺旋和β鏈排列的保守性質(zhì)的知識進(jìn)行輔助。
[0040] 應(yīng)該理解到，CYP102A1是電子轉(zhuǎn)移還原酶域和血紅素單加氧酶域的融合體。這些 域可以通過蛋白酶解或通過全長基因的截斷而切下?；钚晕稽c(diǎn)（底物結(jié)合袋)位于血紅素域 中。CYP102家族的一些成員并不是融合蛋白，但是與CYP102A1血紅素域的序列同源性為 40 %。因此，序列同源性可以單一地在這些環(huán)境下在整個血紅素域范圍內(nèi)進(jìn)行測定。在這些 酶中等價于本發(fā)明中所公開的CYP102A1的等價殘基(equivalent residues)可以通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的序列同源性和結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行識別。
[0041] 在活性位點(diǎn)中的氨基酸是排列或限定在催化期間結(jié)合有底物位點(diǎn)的那些氨基酸 或排列或限定底物在到達(dá)催化位點(diǎn)之前必須經(jīng)過的位點(diǎn)的那些氨