組合物及其在序列測(cè)定和變異檢測(cè)中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一包含探針的組合物及其用途、 CNV變異檢測(cè)方法以及同時(shí)進(jìn)行多種變異檢測(cè)的方法及裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是一個(gè)出生缺陷高發(fā)國(guó)家，根據(jù)衛(wèi)生部最新統(tǒng)計(jì)，每年新增出生缺陷數(shù)約90 萬(wàn)例（占全國(guó)1600萬(wàn)出生人口總數(shù)的5. 6% )，其中30%在出生前后死亡，40%造成終生殘 疾，只有30%可以治愈或糾正。出生缺陷對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)每年造成千億損失，如我國(guó)每年僅僅因 神經(jīng)管缺陷造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)2億元、每年新出生的唐氏綜合征生命周期的總經(jīng)濟(jì) 負(fù)擔(dān)超過(guò)100億元、新發(fā)先天性心臟病生命周期的總經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)超過(guò)126億元。出生缺陷正 成為我國(guó)嬰兒死亡的主要原因（占總死亡率的19% )、兒童殘疾的重要原因和醫(yī)療衛(wèi)生系 統(tǒng)的巨大負(fù)擔(dān)。孕前遺傳檢測(cè)及推廣是有效預(yù)防及減少以上數(shù)據(jù)的方式。
[0003] 近年來(lái)新一代超高通量測(cè)序技術(shù)及目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)發(fā)展，突破了當(dāng)前孕前遺傳 檢測(cè)在單基因、小人群中進(jìn)行的局限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明一方面提供了一個(gè)組合物，該組合物包含探針，所述探針固定在固相載體 上或者游離于溶液中，所述探針至少能夠覆蓋以下15個(gè)基因中的5個(gè)基因的每個(gè)基因區(qū) 域的至少一部分：HBA1、HBA2、HBB、GJB2、SLC26A4、SMN1、DMD、GALT、PAH、F8、F9、ATP7B、 CYP21A2、GAA和PKHD1。這15個(gè)基因，與12種我國(guó)高發(fā)遺傳病相關(guān)，包括地中海貧血（α、 β /ΗΒΑ1、ΗΒΑ2、ΗΒΒ)，遺傳性耳聾（GJB2、SLC26A4)，脊髓性肌肉萎縮癥（SMN1)，丙尿酮癥 (ΡΑΗ)，糖原累積病II型（GAA)，半乳糖血癥（GALT)，甲型血友病（F8)，乙型血友?。‵9)， 肝豆?fàn)詈俗冃裕ˋTP7B)，先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（CYP21A2)，進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良 (DMD)，常染色體隱性多囊腎（PKHD1)。至少一部分，比如各基因的外顯子區(qū)域、和/或基因 與外顯子相連的上下游30bp的內(nèi)含子區(qū)域，和/或全基因區(qū)域，利于后續(xù)與該基因相關(guān)的 單核苷酸突變、結(jié)構(gòu)變異以及剪切突變的檢測(cè)。
[0005] 本發(fā)明的另一方面提供了上述組合物在測(cè)定以下15個(gè)基因中的至少5個(gè)基因的 每個(gè)基因序列的至少一部分中的用途：HBA1、HBA2、HBB、GJB2、SLC26A4、SMN1、DMD、GALT、 PAH、F8、F9、ATP7B、CYP21A2、GAA和PKHD1。獲得序列后，可用于進(jìn)一步序列變異檢測(cè)，確定 變異類型利于檢測(cè)或者輔助檢測(cè)上述疾病。
[0006] 本發(fā)明的另一方面還提供了一種檢測(cè)CNV的方法，該方法包括：A.對(duì)待測(cè)樣本進(jìn) 行目標(biāo)區(qū)域捕獲，對(duì)所述目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序數(shù)據(jù)；B.將所述測(cè)序數(shù)據(jù)與參考序 列進(jìn)行比對(duì)，獲得比對(duì)結(jié)果；C.設(shè)定滑動(dòng)長(zhǎng)度L1和窗口大小L2對(duì)所述目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行切分， 獲得多個(gè)窗口，基于所述比對(duì)結(jié)果，計(jì)算每個(gè)窗口的測(cè)序深度，依據(jù)所述每個(gè)窗口所在的窗 口大小和/或所在的滑動(dòng)長(zhǎng)度區(qū)域大小確定每個(gè)窗口的平均測(cè)序深度，所述多個(gè)窗口的長(zhǎng) 度總和覆蓋所述目標(biāo)區(qū)域的一部分、全部的一次或者全部的多次，所述每個(gè)窗口的測(cè)序深 度為比對(duì)上該窗口的測(cè)序數(shù)據(jù)的量與該窗口大小的比值；D.判斷所述窗口與對(duì)照樣本的 相應(yīng)窗口的平均測(cè)序深度的差異程度，差異顯著則判定存在所述CNV ;其中，A是利用本發(fā) 明一方面提供的組合物進(jìn)行的，L1和L2為自然數(shù)，L1和L2為定值或者為變化數(shù)值。
[0007] 本發(fā)明又一方面提供了一種同時(shí)檢測(cè)多種基因變異的方法，所述多種基因變異包 括點(diǎn)突變、CNV和倒位中的至少兩種，該方法包括：（i)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲，對(duì)所 述目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序數(shù)據(jù)；（ii)基于（i)中的測(cè)序數(shù)據(jù)，同時(shí)檢測(cè)多種基因變異 檢測(cè)；其中，（i)的進(jìn)行利用了本發(fā)明一方面的組合物。
[0008] 本發(fā)明的又一方面還提供了一種檢測(cè)CNV的裝置，該裝置包括：A1.測(cè)序單元，用 于對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲，對(duì)所述目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，所述測(cè)序是利 用本發(fā)明一方面的組合物進(jìn)行的；B1.比對(duì)單元，與所述測(cè)序單元連接，用于將所述測(cè)序數(shù) 據(jù)與參考序列進(jìn)行比對(duì)，獲得比對(duì)結(jié)果；C1.窗口平均測(cè)序深度確定單元，與所述比對(duì)單元 連接，用于設(shè)定滑動(dòng)長(zhǎng)度L1和窗口大小L2對(duì)所述目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行切分，獲得多個(gè)窗口，基于 所述比對(duì)結(jié)果，計(jì)算每個(gè)窗口的測(cè)序深度，依據(jù)所述每個(gè)窗口所在的窗口大小和/或所在 的滑動(dòng)長(zhǎng)度區(qū)域大小確定每個(gè)窗口的平均測(cè)序深度，所述多個(gè)窗口的長(zhǎng)度總和覆蓋所述目 標(biāo)區(qū)域的一部分、全部的一次或者全部的多次，所述每個(gè)窗口的測(cè)序深度為比對(duì)上該窗口 的測(cè)序數(shù)據(jù)的量與該窗口大小的比值；D1.CNV判定單元，與所述窗口平均測(cè)序單元相連， 用于判斷所述窗口與對(duì)照樣本的相應(yīng)窗口的平均測(cè)序深度的差異程度，差異顯著則判定存 在所述CNV。該裝置能夠用以執(zhí)行本發(fā)明一方面提供的CNV檢測(cè)方法的部分或所有步驟。
[0009] 本發(fā)明的再一方面還提供了一種同時(shí)檢測(cè)多種基因變異的裝置，所述多種基因變 異包括點(diǎn)突變、CNV和倒位中的至少兩種，所述裝置包括:A2.測(cè)序單元，用于對(duì)待測(cè)樣本進(jìn) 行目標(biāo)區(qū)域捕獲，對(duì)所述目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，所述測(cè)序的進(jìn)行利用了本發(fā)明 一方面提供的組合物；B2.多種變異同時(shí)檢測(cè)單元，與所述測(cè)序單元相連，用于基于A2中的 測(cè)序數(shù)據(jù)，同時(shí)檢測(cè)多種基因變異檢測(cè)。該裝置能夠用以執(zhí)行本發(fā)明一方面提供的同時(shí)檢 測(cè)多種基因變異的方法的部分或所有步驟。
[0010] 利用本發(fā)明的組合物、方法和/或裝置，能夠準(zhǔn)確檢出點(diǎn)突變，也能很好的檢出外 顯子缺失和/或重復(fù)（CNV)。利用本發(fā)明的組合物，利用基于候選基因的序列信息設(shè)計(jì)探 針，將捕獲富集獲得的DNA片段進(jìn)行測(cè)序，利用本發(fā)明的方法和/或裝置，能夠獲得候選基 因點(diǎn)突變、CNV以及倒位信息。利用本發(fā)明開(kāi)發(fā)的方法和/或裝置，能夠低費(fèi)用、操作方便 地覆蓋多種疾病基因和對(duì)各種突變類型進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的檢測(cè)芯片和信息分析流 程，基于目標(biāo)區(qū)域捕獲技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)，能夠?qū)Ρ硇驼?、無(wú)遺傳病家族史的健康 育齡夫婦，一次性檢測(cè)或者輔助檢測(cè)15個(gè)常見(jiàn)致病基因，篩查或輔助篩查12種我國(guó)高發(fā) 嚴(yán)重遺傳病，包括地中海貧血（α、β /HBA1、HBA2、HBB)，遺傳性耳聾（GJB2、SLC26A4)，脊 髓性肌肉萎縮癥（SMN1)，苯丙尿酮癥（ΡΑΗ)，糖原累積病II型（GAA)，半乳糖血癥（GALT)， 甲型血友?。‵8)，乙型血友?。‵9)，肝豆?fàn)詈俗冃裕ˋTP7B)，先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥 (CYP21A2)，進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD)和常染色體隱性多囊腎（PKHD1)，確定夫妻 雙方以上致病基因的攜帶情況，評(píng)估后代的患病風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)到降低出生缺陷、科學(xué)指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu) 育、提高人口出生質(zhì)量的目的，能夠?qū)崿F(xiàn)準(zhǔn)確、高效進(jìn)行孕前遺傳檢測(cè)。能夠根據(jù)各地單基 因疾病發(fā)病趨勢(shì)進(jìn)行因地制宜的優(yōu)化并將此模式推廣至全國(guó)甚至全球，推進(jìn)生育醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 的科學(xué)技術(shù)發(fā)展與產(chǎn)業(yè)進(jìn)步。本發(fā)明的組合物、方法和/或裝置，能夠提供一種針對(duì)大眾的 孕前基因篩查方法，可以一次性篩查12種我國(guó)高發(fā)的隱性遺傳病，篩查基因的突變類型全 面而準(zhǔn)確。能夠利用目標(biāo)區(qū)域捕獲結(jié)合高通量測(cè)序，通過(guò)變異信息分析方法，同時(shí)檢測(cè)候選 基因的點(diǎn)突變和CNV，方便快捷，準(zhǔn)確度高。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中：
[0012] 圖1是本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中的實(shí)驗(yàn)流程圖；
[0013] 圖2是本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中的信息分析流程圖；
[0014] 圖3是本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中的CNV檢測(cè)原理圖；
[0015] 圖4是本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中的的F8的22號(hào)內(nèi)含子倒位檢測(cè)結(jié)果；
[0016] 圖5是本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中的的F8的1號(hào)內(nèi)含子倒位檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，提供了一個(gè)組合物，該組合物包含探針，所述探針固 定在固相載體上或者游離于溶液中，所述探針至少能夠覆蓋以下15個(gè)基因中的5個(gè)基因的 每個(gè)基因區(qū)域的至少一部分：HBA1、HBA2、HBB、GJB2、SLC26A4、SMN1、DMD、GALT、PAH、F8、F9、 ATP7B、CYP21A2、GAA和PKHD1。這15個(gè)基因，與12種我國(guó)高發(fā)遺傳病相關(guān)，包括地中海貧 血（α、β /HBA1、HBA2、HBB)，遺傳性耳聾（GJB2、SLC26A4)，脊髓性肌肉萎縮癥（SMN1)，丙 尿酮癥（ΡΑΗ)，糖原累積病II型（GAA)，半乳糖血癥（GALT)，甲型血友?。‵8)，乙型血友病 (F9)，肝豆?fàn)詈俗冃裕ˋTP7B)，先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（CYP21A2)，進(jìn)行性假肥大性肌營(yíng) 養(yǎng)不良（DMD)，常染色體隱性多囊腎（PKHD1)。至少一部分，比如所包含的基因的外顯子區(qū) 域、和/或基因與外顯子相連的上下游30bp的內(nèi)含子區(qū)域，和/或全基因區(qū)域，利于后續(xù)與 該基因相關(guān)的單核苷酸突變、結(jié)構(gòu)變異以及剪切突變的檢測(cè)。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述探針至少能夠覆蓋上述15個(gè)基因中的10 個(gè)基因的每個(gè)基因區(qū)域的至少一部分。在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述探針能夠覆 蓋上述15個(gè)基因中的每個(gè)基因區(qū)域的至少一部分。至少一部分，比如各基因的外顯子區(qū) 域、和/或基因與外顯子相連的上下游30bp的內(nèi)含子區(qū)域，和/或全基因區(qū)域，利于后續(xù)與 該基因相關(guān)的單核苷酸突變、結(jié)構(gòu)變異以及剪切突變的檢測(cè)。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述探針的設(shè)計(jì)是依據(jù)預(yù)覆蓋區(qū)域在參考基 因組上的起始和終止位置，從位置的一端開(kāi)始，在所述參考基因組上依次截取預(yù)定序列長(zhǎng) 度直至所述位置的另一端，所述預(yù)定序列長(zhǎng)度的長(zhǎng)度總和至少為所述預(yù)覆蓋區(qū)域大小的1 倍，所述預(yù)覆蓋區(qū)域選自所述15個(gè)基因中至少5個(gè)基因的每個(gè)基因區(qū)域的至少一部分，所 述預(yù)定序列長(zhǎng)度為50~250nt，所述預(yù)定序列長(zhǎng)度即為預(yù)定探針長(zhǎng)度。在本發(fā)明的一個(gè)具 體實(shí)施方式中，預(yù)定探針長(zhǎng)度的總和為目標(biāo)區(qū)域（預(yù)覆蓋區(qū)域）大小的5倍，即設(shè)計(jì)的每條 探針大多至少有5個(gè)拷貝，各區(qū)域探針的拷貝數(shù)可根據(jù)目標(biāo)區(qū)域序列堿基組成及對(duì)目標(biāo)區(qū) 域中的部分或全部的捕獲需求調(diào)整。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，該組合物中的探針能夠覆蓋的區(qū)域包括： chrl6:59501-60501, chrl6:84266-84414, chr16:84536-84781, chrl6:84831-85101, chrl6:93451-94030, chrl6:97141-97648, chrl6:101131-101752, chrl6:103124-104124, chrl6:131785-131980, chr 1 6:163436-163820, chr 1 6:17230 1-17330 1, chrl6:188799-189799, chr16:193176-194176 , chr16:195937-196208 , chrl6:197099-201899, chr 1 6:201949-203073, chr 1 6:203090-203162, chrl6:203 170-203270, chr 1 6:203799-206016, chr 1 6:206540-207072, chrl6:207565-209099, chr 1 6:2091 10-209857 , chr16:209909-210084 , chrl6:210715-210790, chr16:2 10835-2 1 1 7 1 3 , chr16:21 1845-2 1 1 9 1 0 , chrl6:212174-221360, chr16:221499-224753 , chr16:225065-2339 1 0 , chrl6:234200-236401, chr16:237220-237735 , chr16:237800-239636 , chrl6:242780-243149, chr16:254625-255 1 99 , chr16:258005-258928 , chr 16:303840-304852, chr16:313300-314300 , chr 13:52506776-52508891, chrl3:52508892-52509195, chr13:52509699-52509861, chr13:52511382-52511559, chr13:52511582-52511845, chr 13 : 52513157-52513359, chr13:52515187-52515390, chrl3:52516492-52516720, chrl3:52518215-52518457, chrl3:52520390-52520644, chr 13:52523768-52523962, chr 13:52524113-52524327, chr 13:52524378-52524565, chrl3:52531622-52531773, chrl3:52532417-52532710, chrl3:52534156-52534157, chrl3:52534254-52534488, chr13:52535943-52536079, chr13:52538978-52539199, chr13:52542550-52542773, chrl3:52544598-52544915, chr13:52548041-52549334, chrl3:52585393-52585473, chr 13:52585474-52585660 , chr11:47599-48599, chrl 1 :67836-68836, chr 1 1 :9566 1-9666 1, chr 1 1 : 10 2 6 5 8- 103658, chrll:5133611-5135542, chrl1:5151625-5154197, chrl1:5161020-5162526, chrl1:5165060-5166060, chrl1:5167335-5168901, chrl1:5169775-5171446, chrll:5173950-5174950, chr11:5179167-5180167 , chrl1:5180196-5181196, chrll:5187425-5187801, chrl1:5190647-5194526, chrl1:5194530-5197746, chrll: 5198220-5200664, chrll:5207460-5209762, chrll:5215188-5216188, chrll:5217440-5218440, chrll:5218705-5219705, chrll:5220930-5223803, chrll:5223825-5224976, chrll:5227490-5229196, chrll:5230655-5232014, chrll:5233456-5234456, chrll:5235175-5236175, chrll:5236680-5238663, chrll:5239076-5240500, chrll:5240607-5241607, chrll:5243655-5249785, chrll:5249788-5251275, chrll:5252088-5253088, chrll:5253894-5256137, chrll: 5256268-5257393, chrll:5257616-5260578, chrll:5261109-5262109, chrll:5263479-5264479, chrll:5264956-5266333, chrll:5266863-5268837, chrll:5269306-5272017, chrll:5272027-5273936, chrll:5274421-5276011, chrll:5276020-5276313, chrll:5277190-5281370, chrll:5289580-5292060, chrll:5296973-5297773, chrll:5300302-5301302, chrll:5301646-5302822, chrll:5305045-5309165, chrll:5316550-5319380, chrll:5331720-5334343, chrll:5340085-5341085,chrll:5342735-5347056, chrll:5349993-5350993, chrll:5354065-5357231, chr13:20766920-20766921, chr6:31947356-31948352, chr6:31973287-31974926，chr6:31975247-31975249，chr6:31975263-31976013， chr6:31976102-31976233， chr6:31976572-31976708， chr6:31978697-31978852， chr6:31979037-31979174, chr6:31980912-31981045, chr6:31981442-31981762， chr6:31983786-31987153，chr6:31988701-3199002