一種人類金屬硫蛋白-4融合蛋白表達載體的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于基因工程和發(fā)酵工程領域，涉及一種人類金屬硫蛋白-4融合蛋白表達 載體，尤其是涉及一種具有伴侶樣蛋白功能的人類游離脂肪酸結合蛋白與人類金屬硫蛋白 的融合表達。
【背景技術】
[0002] 1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學作用時，從動物器官分離出一種新 的蛋白質，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質稱為金屬硫蛋白（英文為 Metallothionein，簡稱MT) 〇
[0003] 關于金屬硫蛋白，全球從1978年到1999年，先后在瑞士、日本、美國共舉行了四次 國際專題研討會，第五次國際專題研討會于2005年10月在北京召開。1987年我國將MT列入 [863]計劃，"八五"、"九五"重大攻關項目，1994年列入國家級[火炬計劃];2003年MT項目被 國家科技部列為"國家科技成果重點推廣計劃項目，1995年聯(lián)合國將MT列入向世界各國推 薦的生物技術產(chǎn)品。由此可見從國內(nèi)到國外對MT的研究、開發(fā)、推廣、應用的高度重視。
[0004] 金屬硫蛋白（Metallothionein，MT)，又稱疏基金屬結合蛋白。一類非酶蛋白質，除 含有鎘(Cd)、鋅(Zn)的MT外，在自然界也存在含有銅(Cu)、萊(Hz)、金(Au)、鉍(Bi)等元素的 MTJT的蛋白分子內(nèi)不含有芳香族氨基酸和組氨酸。讓MT中50%的金屬離子發(fā)生解離的pH 值分別為：Zn-MT: 3 · 5~4 · 5 ; Cd-MT: 2 · 5~3 · 5 ; Cu-MT〈1 · 0。因 MT缺乏芳香族氨基酸，故在 280nm處無吸收峰，然而具有與金屬相關的吸收峰。去金屬的MT在190nm處有一個吸收峰。所 有脊椎動物、多數(shù)植物和微生物體內(nèi)都含有MT。無論是自然產(chǎn)生還是誘導產(chǎn)生的MT，其氨基 酸組成基本相同、主要不同在所含金屬及其含量。
[0005] 人類MT按分子特征和分布分為四個亞群:]\0'1、]\0'2、]\?'3、]\?'4。]\0'1又分9個亞類，]\?'2 又分MT2a和ΜΤ21^ΜΤ1和MT2分布全身，MT3分布于腦，MT4主要分布于皮膚。
[0006] 自由基是人體衰老的第一大元兇，自由基還與人類若干中老年疾病緊密相關，導 致人體免疫力逐步下降，ΜΤ是目前已知的最好的自由基清除劑，減少自由基就能延緩人體 衰老步伐。同時，ΜΤ也是目前唯一有效的重金屬解毒和清除蛋白。人體重金屬超標或中毒， 損害肝、腎、骨、腦和記憶功能，引發(fā)多種疾病。
[0007] 大量的科學實驗和臨床結果表明：ΜΤ在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、 治療或緩解消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎癥、各種癌癥、保護皮膚、減輕吸煙及環(huán)境污染對 人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效。
[0008] 目前ΜΤ產(chǎn)品主要從兔肝、馬腎、豬肝和微生物（如粗脈孢菌）等中提取，成本高、產(chǎn) 量低，抑制了她的廣泛使用，比如食品、飲品、化妝品等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體。
[0010] 本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0011] -種人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載體，所述的人類金屬硫蛋白融合蛋白表達載 體是將人類金屬硫蛋白-4(MT4)的編碼序列作為目標蛋白編碼序列插入伴侶樣蛋白的融合 蛋白表達載體的多克隆區(qū)所得;所述的伴侶樣蛋白的融合蛋白表達載體上游含有人類游離 脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列，人類游離脂肪酸結合蛋白編碼序列下游包含一段柔性接頭 區(qū)和用于插入目標蛋白編碼序列的多克隆區(qū)。
[0012] 所述的人類游離脂肪酸結合蛋白與人類天然游離脂肪酸結合蛋白的同源性等于 或大于85%，所述的人類游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列優(yōu)選為經(jīng)過密碼子優(yōu)化的編碼 序列。
[0013] 所述的人類游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列進一步優(yōu)選如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 所述的柔性接頭區(qū)和多克隆區(qū)序列優(yōu)選如SEQ ID NO.3所示。
[0015] 所述的人類金屬硫蛋白-4其氨基酸序列優(yōu)選與人類天然金屬硫蛋白的氨基酸序 列的同源性等于或大于75%。
[0016] 人類金屬硫蛋白-4(MT4)氨基酸序列如SEQ ID N0.22所示，該蛋白經(jīng)密碼子優(yōu)化 后的核苷酸編碼序列優(yōu)選如SEQ ID N0.21所示。
[0017] 所述的表達載體中人類游離脂肪酸結合蛋白-6的編碼序列的上游還包含編碼用 于分離純化融合蛋白的標簽的序列，優(yōu)選編碼組氨酸標簽的序列。
[0018] 有益效果：
[0019] 1.本發(fā)明構建的重組表達載體能夠促進或誘導被融合的下游人類金屬硫蛋白融 合蛋白的折疊，具有蛋白伴侶樣蛋白的特性。
[0020] 2.該FABP蛋白為人源性，理論上不存在對人體的免疫原性，適于制藥工業(yè)中解決 目標蛋白包涵體問題，并且可以保留融合蛋白一同制藥。
【附圖說明】
[0021] 圖l、hFABP融合蛋白示意圖
[0022] 圖2、pET28a-hFABP6表達載體物理圖
[0023] 圖 3、pET28-hFABP6-MT4 環(huán)狀質粒物理圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過具體實施例對本發(fā)明的應用進行說明，所舉的實施例僅是對本發(fā)明的應 用作概括性例示，有助于更好地理解本發(fā)明的用途，但并不會限制本發(fā)明應用范圍。下述實 施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法;所述試劑和材料，如無特殊說明，均可 從商業(yè)途徑獲得。
[0025] 實施例1
[0026] -種伴侶樣蛋白的融合蛋白表達載體的構建方法，包括以下步驟：
[0027] 步驟一、hFABP的編碼DNA的人工合成和優(yōu)化，本實施例以hFABP6為例：
[0028] (1)取hFBP6氨基酸序列（SEQ ID勵.2)逆向翻譯成0嫩編碼序列，經(jīng)過密碼子優(yōu)先 性、核糖體結合區(qū)序列優(yōu)化獲得序列（SEQ ID N0.1)，但不限于此序列，以翻譯后的蛋白質 氨基酸序列同源性等于或大于85 %為限。
[0029] (2)將該編碼序列分段合成寡核苷酸單鏈DNA(SEQ ID N0.5~18)。
[0030] (3)多聚酶鏈式反應（PCR)法合成全長編碼DNA序列，包含5'-6xHisTag(SEQ ID NO.4)、hFBP6氨基酸編碼序列、3'-柔性接頭序列(Linker)和多克隆區(qū)（SEQ ID NO.3)。
[0031] (4)經(jīng)測序反應驗證全長DNA序列（SEQ ID NO. 19所示）。
[0032] 步驟二、載體制備：
[0033] (1)將步驟一合成得到的hFABP6編碼序列（SEQ ID N0.19)，包含5'-6xHisTag、3'- 柔性接頭序列(Linker)和多克隆區(qū)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切消化、瓊脂糖凝膠純化，獲得兩端 分別是Nco I和Xho I的粘性接頭的插入片段。
[0034] (2)制備表達載體pET28a，但不限于該表達載體：
[0035] ①取pET28a載體lyg，用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I雙酶切。
[0036]②瓊脂糖凝膠電泳分離、純化線性化后的pET28a載體。
[0037]③用T4 DNA連接酶將包含hFABP6序列的插入片段和步驟②制備好的pET28a表達 載體連接。
[0038]④轉化大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5a，含卡那霉素(Kan)抗生素的培養(yǎng)皿培養(yǎng)過夜，然 后挑取單菌落，PCR法鑒定陽性克隆，常規(guī)制備DNA質粒。
[0039]⑤將陽性克隆質粒送交DNA序列分析，選取和保留正確序列的克隆供表達測試。 [0040]⑥載體命名為pET28a-hFABP6(SEQ ID N0.20)
[00411步驟三、載體的表達測試：
[0042] (1)將步驟二得到的pET28a-hFABP6載體DNA質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài) 細胞，獲得Kan抗性的菌落。
[0043] (2)挑取單菌落數(shù)個，LB培養(yǎng)基