中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程與技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在搖瓶和生物反應(yīng)器中生產(chǎn)灰樹花多糖的生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]灰樹花是一種珍貴的天然真菌，又名貝葉多孔菌、千佛菌、栗干蘑、云蕈、蓮花菌等。灰樹花含有多種生理活性物質(zhì)，如多糖(糖蛋白)、核酸、多酚等，其中，灰樹花多糖(糖蛋白復合體)是研究的重點。真菌多糖是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的另一種有待深入研究的生物大分子物質(zhì)。藥用真菌多糖是主要存在于菌絲體細胞內(nèi)分泌到細胞外的大分子物質(zhì)，是很好的免疫調(diào)節(jié)增強劑，可以從根本上提高機體免疫功能。灰樹花多糖的主要單糖組成為D-葡聚糖，此外還可能含有少量的D-木糖、D-甘露糖、D-巖藻糖、L-阿拉伯糖、龍膽二糖、半乳糖等。具有生物活性的灰樹花多糖的基本結(jié)構(gòu)帶有β-(1-6)側(cè)鏈的i3-(l-3)-D-葡聚糖，分支度約為33%，灰樹花多糖的藥理活性與組分中基本結(jié)構(gòu)的含量有關(guān)。在灰樹花藥用價值被廣泛揭示的同時，灰樹花的產(chǎn)量和質(zhì)量成為抑制灰樹花應(yīng)用的瓶頸，因為在自然界中野生的灰樹花十分稀少，其灰樹花多糖遠不能滿足人們的需要。于是人們開始栽培灰樹花，然而人工栽培灰樹花從播種到收獲一般需要兩到三個月，占地面積大，而且灰樹花的產(chǎn)量與質(zhì)量易受環(huán)境氣候及蟲害的影響。同人工栽培灰樹花相比，發(fā)酵法生產(chǎn)灰樹花多糖由于生產(chǎn)周期短(一般為十幾天)、勞動力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點被認為是一種有效的方法。發(fā)酵法生產(chǎn)所存在的問題是如何提高生物量和產(chǎn)量以及設(shè)備的單位體積得率，從而降低成本。批培養(yǎng)所獲得的生物量和具有生物活性的多糖產(chǎn)量較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法。
[0004]本發(fā)明的中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)，包括:
菌種來源:
中國微生物菌種保藏管理中心提供并鑒定，Grifolafrondosa,保藏編號Gf-1,菌株別號 ATCC60891。
[0005]培養(yǎng)方法:
用上述菌屬的菌種采用搖瓶補料培養(yǎng)法和生物反應(yīng)器補料培養(yǎng)法，以葡萄糖或蔗糖為碳源、蛋白胨和酵母粉為氮源作為種子培養(yǎng)基，并加入適量的無機鹽和維生素，將菌種接種到液體培養(yǎng)基，通過液體發(fā)酵而獲得含有灰樹花胞外多糖的發(fā)酵液以及含有灰樹花胞內(nèi)多糖的灰樹花菌絲體?，F(xiàn)分別敘述如下:
1、搖瓶補料培養(yǎng)法
接種50-1500毫克干重/升種子于有培養(yǎng)基的搖瓶中，24-28度，80-180轉(zhuǎn)/分鐘回旋培養(yǎng)，當殘余糖濃度為30-0.1克/升時，補加5-60克/升的葡萄糖或乳糖或麥芽糖，繼續(xù)培養(yǎng)，在第10-30天結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液。在補料培養(yǎng)階段細胞量增加，同時也有利于灰樹花胞外多糖、胞內(nèi)多糖的合成；
2、生物反應(yīng)器補料培養(yǎng)法:
接種50-1500毫克干重/升種子于有培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器中，24-28度，通氣速率為
0.02-3.50升/分鐘，攪拌速率10-1000轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)液中溶解氧濃度為5%_80%。培養(yǎng)4-30天。當殘余糖濃度為30-0.1克/升時，補加5-60克/升的葡萄糖或乳糖或麥芽糖，在第10-30天結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液。在補料培養(yǎng)階段細胞量增加，同時也有利于灰樹花胞外多糖、胞內(nèi)多糖的合成。
[0006]培養(yǎng)基可以采用常規(guī)的含有碳源、氮源、無機鹽和維生素等成分的培養(yǎng)基。其中:碳源包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、糖蜜或土豆汁等；氮源有酵母粉、蛋白胨、酪蛋白或黃豆粉等；無機鹽包括腿#04、1(2即04和1%504。其中葡萄糖、蔗糖和麥芽糖有利于胞外多糖合成，乳糖有利于胞內(nèi)多糖的合成。有機氮源有利于細胞吸收利用。
[0007]采用常規(guī)的分析方法對本發(fā)明產(chǎn)物進行分析測試(胞外多糖通過乙醇沉淀法獲得；胞內(nèi)多糖通過堿溶解菌絲體后，乙醇沉淀法獲得；以上所說的方法均為現(xiàn)有技術(shù)，在許多文獻中已有闡述，本發(fā)明不再贅述)，結(jié)果表明，所述的方法可以同時獲得灰樹花胞外多糖與胞內(nèi)多糖。細胞干重可達20.89g/升(大于20克干重/升，達到高密度培養(yǎng));胞外、胞內(nèi)多糖分別為1.88克/升、2.48克/升。
[0008]本發(fā)明生物可達20.89g/升，達到細胞高密度，明顯超過以前的文獻報道的生物量。
[0009]胞外多糖產(chǎn)量為1.88克/升，同其他報道相比較為接近。
[0010]通過本方法可以在搖瓶和生物反應(yīng)器中通過補料達到高密度培養(yǎng)，以較高產(chǎn)率獲得灰樹花和灰樹花多糖。相對于現(xiàn)有采用類似液體發(fā)酵手段生產(chǎn)工藝而言，本方法由于不會增加復雜附加設(shè)備且培養(yǎng)技術(shù)簡便，可以在工業(yè)上實現(xiàn)灰樹花多糖在生物反應(yīng)器中的同時高產(chǎn)，大幅度提高生產(chǎn)過程的經(jīng)濟效益，也會帶來可觀的社會效益。本發(fā)明產(chǎn)品均獲得人們廣泛認可，具有較高的藥用價值，可廣泛用于醫(yī)藥和視頻保健等行業(yè)。
【具體實施方式】
[0011]為了理解本發(fā)明，下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不限制本發(fā)明。
[0012]對照例I
搖瓶批培養(yǎng)法:發(fā)酵液體培養(yǎng)基中含有乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，KH2PO4 I克/升，MgSO4 0.5克/升，VBl 0.05克/升。發(fā)酵溫度為26度，在250毫升搖瓶中接種33毫克菌絲體于50毫升培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天(對照組沒有補料)。結(jié)束發(fā)酵，收獲菌絲體和發(fā)酵液，并進行以下分析測定:
在5000rpm下離心分離獲得細胞干重15.8克/升；發(fā)酵液中加入4倍體積的95%乙醇，混合過夜，在1000rpm下離心沉淀得胞外灰樹花多糖。經(jīng)熱水溶解，采用苯酚-硫酸法測定多糖產(chǎn)量為0.8克/升；
菌絲體100毫克，加入2毫升體積蒸餾水，90度加熱6h，1000rpm下離心取上清，采用苯酚-硫酸法測定胞多內(nèi)糖產(chǎn)量為1.8克/升。
[0013]實施例1: 生物反應(yīng)器批培養(yǎng)法:
其它條件同對照I (發(fā)酵液體培養(yǎng)基中含有乳糖35克/升，蛋白胨5克/升，酵母粉5克/升，KH2PO4 I克/升，MgSO4 0.5克/升，VBl 0.05克/升。發(fā)酵溫度為26度，在250毫升搖瓶中接種33毫克菌絲體于50毫升培養(yǎng)基)，當培養(yǎng)液的殘余糖濃度小于5克/升時(發(fā)酵第十三天，此時殘余糖濃度為4.90克/升)，添加15克/升的葡萄糖，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)18天后，結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液，進行有效成分分析。測定方法同實例1，結(jié)果，細胞干重、胞外多糖、胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量分別為19.75克/升，1.69克/升與2.23克/升。
【主權(quán)項】
1.一種中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法，其特征在于:采用的微生物為灰樹花屬菌種，以葡萄糖或蔗糖為碳源、蛋白胨和酵母粉為氮源作為種子培養(yǎng)基并加入適量的無機鹽和維生素，具體步驟如下: 接種種子于有培養(yǎng)基的搖瓶或生物反應(yīng)器中，采用常規(guī)的方法進行培養(yǎng)，當殘余糖濃度為30-0.1克/升時，補加5-60克/升的葡萄糖或乳糖或麥芽糖，繼續(xù)培養(yǎng)，在第10-30天結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液。2.如權(quán)利要求1所述的中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法，其特征在于，在搖瓶培養(yǎng)是在20-35攝氏度，80-180轉(zhuǎn)/分鐘回旋條件下進行的。3.如權(quán)利要求1所述的中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法，其特征在于，在生物培養(yǎng)器中培養(yǎng):通氣速率為0.02-3.50升/分鐘，攪拌速率10-1000轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)液中溶解氧濃度為5%-80%。4.如權(quán)利要求1-3任一所述的中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法，其特征在于，采用的菌種為中國微生物菌種保藏管理中心提供并鑒定，Grifolafrondosa,保藏編號Gf-1,菌株別號ATCC60891。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中間補料發(fā)酵生產(chǎn)灰樹花多糖的方法。本發(fā)明接種種子于有培養(yǎng)基的搖瓶或生物反應(yīng)器中，采用常規(guī)的方法進行培養(yǎng)，當殘余糖濃度為30-0.1克/升時，補加5-60克/升的葡萄糖或乳糖或麥芽糖，繼續(xù)培養(yǎng)，在第10-30天結(jié)束培養(yǎng)，收獲菌絲體和發(fā)酵液。本發(fā)明在灰樹花細胞培養(yǎng)過程中，在適當時機補加一定的營養(yǎng)物質(zhì)，促進細胞生長，提高生物量，從而提高灰樹花多糖的產(chǎn)量。本發(fā)明所述的方法為一種更加接近工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模，更加具有工業(yè)化前景的生產(chǎn)方法，從而為工業(yè)化經(jīng)濟生產(chǎn)灰樹花多糖奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12R1/645, C12P19/04
【公開號】CN105441506
【申請?zhí)枴緾N201410519325
【發(fā)明人】王連民, 劉珂飛, 高應(yīng)瑞
【申請人】天津生機集團股份有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年9月30日