一種雞生長性能選育分子標記ghr基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及動物分子育種的基因工程技術(shù)，特別是一種雞生長性能選育分子標記 GHR基因及其應(yīng)用技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 生長激素受體(GHR)處于GH-GHR-IGF軸上，通過介導(dǎo)生長激素(GH)來調(diào)控IGFs的 表達，從而在體內(nèi)起著重要的調(diào)節(jié)生長發(fā)育的作用。GH和GHR結(jié)合可調(diào)控動物生長，具有調(diào) 節(jié)營養(yǎng)分配、促進蛋白合成、減少脂肪沉積、促進骨骼肌肉生長、提高動物生長速度和飼料 報酬等功能，并參與動物免疫、生殖、泌乳等生理功能和代謝的調(diào)節(jié)。
[0003] GHR為動物正常發(fā)育所必需。GH在促進動物生長、發(fā)育等代謝過程中起重要作用， 而其發(fā)揮生理作用的第一步是與靶細胞膜表面的GHR結(jié)合，由GHR介導(dǎo)將信號傳入細胞內(nèi)從 而產(chǎn)生一系列的生理效應(yīng)，因此組織中GHR量的多少及功能的正常與否將會影響GH生理效 應(yīng)的發(fā)揮。而GH作用于GHR，產(chǎn)生IGF-1，IGF-1作用于多種類型的細胞，促進細胞的分裂，促 進DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成。盡管動物的許多組織器官都產(chǎn)生IGF-1，但血液中的IGF-1主要 來源于肝臟，因此肝臟GHR在此起關(guān)鍵性作用。
[0004] 在GHR基因的研究中，人的LTD矮小癥、性連鎖矮小雞是兩個研究得比較透徹的因 GHR基因突變導(dǎo)致生長緩慢和矮小的例子，肝臟缺乏有效的GHR，或是GHR基因的突變，使得 GH和GHR的有效結(jié)合匱乏，導(dǎo)致生長軸作用通路的中斷，最終導(dǎo)致IGF-1水平低下，即使血漿 GH濃度明顯高于正常雞，生長仍然受到阻礙，從而SLD雞的體型明顯低于正常雞個體。
[0005] 改善動物的生長性能是家畜品種改良的重要目標。分子標記從本質(zhì)上揭示遺傳變 異及其變異規(guī)律，在動物的育種中發(fā)揮了越來越重要的作用，為動物DNA分子標記輔助選擇 奠定了一定的基礎(chǔ)。在畜禽育種過程中，找到與畜禽生長速度相關(guān)的分子標記，對畜禽育種 有著重要的意義。因此，探索GHR基因?qū)仪萆L性能的影響，可為優(yōu)質(zhì)家禽的品種改良和 選育提供一定的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于以上研究背景，本發(fā)明利用云南特有的武定雞和大圍山微型雞為研究材料， 采用目標區(qū)域深度重測序的方法，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選和鑒定與大圍山微型雞和武 定雞生長性能相關(guān)SNP位點，并進行分子標記，在GHR基因內(nèi)含子5上篩選到與體重有顯著相 關(guān)的571A/G位點，并以此位點作為分子標記對雞的選育進行輔助選擇，為云南本土雞的選 育提供重要的科學(xué)借鑒。
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種雞生長性能選育分子標記GHR基因，通過設(shè)計特異性引 物克隆了大圍山微型雞和武定雞GHR基因編碼區(qū)的全長序列（CDS)，如SEQ.ID.N0.1和 SEQ. ID.NO. 2，GenBank登陸號分別為KC242242和KC242241;并按照克隆出來的CDS序列預(yù)測 了GHR基因編碼區(qū)的蛋白質(zhì)序列，氨基酸序列如SEQ.ID.N0.3和SEQ.ID.N0.4。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是GHR基因作為雞體重性狀選育分子標記在在云南大圍山微 型雞體重性狀選育中的應(yīng)用，并采用PCR-RFLP方法，檢測GHR基因內(nèi)含子的多態(tài)性，并分析 了不同基因型與體重的關(guān)聯(lián)性，即通過現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)篩選出與大圍山微型雞的體重 性狀有顯著相關(guān)性的571A/G位點，以此位點作為體重性狀的分子標記對大圍山微型雞的選 育進行輔助選擇。
[0009] 作為上述分子標記GHR基因的應(yīng)用，本發(fā)明還公開了一種大圍山微型雞選育中遺 傳改良的方法，在大圍山微型雞雞群中，檢測GHR基因內(nèi)含子5上的571A/G位點(GHR基因第 75630位點），篩選GHR基因 mRNA表達量較高的個體，淘汰GHR基因 mRNA表達量較低的個體。
[0010] 本發(fā)明的有益效果：
[0011] 1、本發(fā)明通過設(shè)計特異性引物克隆了大圍山微型雞和武定雞GHR基因編碼區(qū)的全 長序列（CDS)，實現(xiàn)對大圍山微型雞和武定雞的GHR基因進行完全測序，并探索云南本土雞 種GHR基因上的突變位點，為云南本土雞種提供一定的理論依據(jù)
[0012] 2、本發(fā)明采用目標區(qū)域深度重測序的方法，結(jié)合生物信息學(xué)分析，利用PCR-RFLP 技術(shù)對GHR基因進行多態(tài)性分析，篩選出與大圍山微型雞的體重性狀有顯著相關(guān)性的GHR基 因內(nèi)含子5上的571A/G位點，并以此位點作為分子標記對雞的體尺性狀選育進行輔助選擇， 為云南本土雞的選育提供重要的科學(xué)借鑒。
[0013] 3、本發(fā)明還提供了一種大圍山微型雞選育中遺傳改良的方法，可通過對GHR基因 分子標記的檢測，檢測GHR基因內(nèi)含子5上的571A/G突變位點(GHR基因內(nèi)含子5第571位點）， 篩選GHR基因 mRNA表達量較高的個體，淘汰GHR基因 mRNA表達量較低的個體。
【附圖說明】
[0014] 圖1、2為本發(fā)明GHR基因 GHR-intron2GG型測序圖譜；
[0015] 圖3、4為本發(fā)明GHR基因 GHR-intron2AA型測序圖譜；
[0016] 圖5為本發(fā)明GHR基因 GHR-intron5AA型測序圖譜； 圖6為本發(fā)明GHR基因 GHR-intron5GG型測序圖譜； 圖7為本發(fā)明GHR基因 GHR-intron5AG型測序圖譜； 圖8為本發(fā)明GHR基因 GHR-P1基因 TT型測序圖譜； 圖9為本發(fā)明GHR基因 GHR-P1基因 CT型測序圖譜；
【具體實施方式】
[0017] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例和附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整 地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒?發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0018] 一、體重性狀指標的測定
[0019] 本試驗采用20周齡大圍山微型雞和武定雞各100只，公母各半，進行體重測量。20 周齡武定雞體重顯著高于大圍山微型雞。
[0020] 表1不同品種雞體重及體尺性狀的比較分析
[0021]
[0022] 注:P.>0.05,差異不顯著;0.01〈?〈0.05，差異顯著;？〈0.01，差異極顯著。
[0023] 二、血液激素水平指標樣品采集
[0024]采血前均禁食12小時，于次日早晨進行翅靜脈采血。制備血漿，檢測GHR激素含量。 結(jié)果顯示武定雞血液中GHR激素含量高于大圍山微型雞。
[0025] 表2 20周齡微型雞和武定雞血漿中GHR激素含量
[0026]
[0027] 三、GHR基因 CDS區(qū)的克?。?br>[0028] 1)提取武定雞和大圍山微型雞肌肉組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。
[0029] 2)根據(jù)GenBank中原雞（Gal lus gal lus)的GHR基因序列（GenBank登錄號為： M74057，設(shè)計6對引物分別為:GHR-1、GHR-2和GHR-3，剩下的GHR-4、GHR-5和GHR-6，全部覆蓋 了GHR基因的編碼區(qū)（⑶S)全序列。
[0030] 表3 GHR基因引物信息
[0031]
[0033] 3)采用PCR擴增試劑盒擴增目標片段。
[0034] 4)采用UNIQ柱式DNA膠回收試劑盒純化PCR目標產(chǎn)物DNA片段。
[0035] 6)對GHR基因進行擴增片段連接反應(yīng)后，進行基因克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，取合格菌液進行 測序。
[0036] 7)大圍山微型雞和武定雞GHR基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收，克隆測序。測序結(jié)果通過 人工仔細核對堿基及其所對應(yīng)的譜圖，更正錯誤的堿基，經(jīng)DNAStar分析軟件比對并拼接堿 基序列。
[0037] 測序結(jié)果：
[0038] 以GenBank原雞GHR基因（NM_001001293)mRNA為參考，根據(jù)本次測序結(jié)果比對和拼 接大圍山微型雞GHR基因的序列。將測序所得到的3個序列核對、校正和拼接完成大圍山微 型雞GHR基因 CDS區(qū)全序列1827bp，如SEQ.ID.N0.1，編碼608個氨基酸，氨基酸序列如 SEQ. ID. N0.3。大圍山微型雞GHR基因 CDS區(qū)全序列成功提交GenBank，登陸號:KC242242。武 定雞GHR基因 CDS區(qū)全序列1827bp，如SEQ.ID.N0.2,編碼608個氨基酸，氨基酸序列如 SEQ. ID. N0.4。武定雞GHR基因 CDS區(qū)全序列成功提交GenBank，登陸號:KC242241。
[0039] 通過大圍山微型雞GHR基因 CDS區(qū)（KC242242)、武定雞GHR基因 CDS區(qū)（KC2422410與 雞GHR基因（NM_001001293)mRNA全序列（參考序列)編碼氨基酸比對結(jié)果顯示，在GHR編碼區(qū) 共檢測到三個突變位點：GHR CDS 150C/G，GHR CDS152C/G及GHR CDS 1726G/ADGHR CDS 150 C/G，GHR⑶S152 C/G兩個位點武定雞和微型雞之間相同，地方雞種與NCBI參考基因序 列不同，這兩個突變位點定性為品種間的差異，而不是影響微型雞體型的主要突變位點。而 在微型雞GHR編碼區(qū)1726位點上發(fā)現(xiàn)一個由A替代G的SNP突變，GHR CDS 1726 G/A，該位點 為非同義突變，所編碼的氨基端序列發(fā)生改變，由甘氨酸變?yōu)榻z氨酸，武定雞與NCBI參考基 因組相同，均為甘氨酸。該位點改變可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)果發(fā)送改變，影響GH與GHR的結(jié)合活 性，從而導(dǎo)致生長軸信號通路改變。
[0040] 四、利用PCR-RFLP技術(shù)對GHR基因進行多態(tài)性分析
[0041 ] 1)提取血液基因組DNA，進行PCR實驗。
[0042] 2)設(shè)計三對引物，分別位于GHR基因 intron-2 (GHR-intron 2)，intron-5 (GHR-intron 5)以及exon_3(GHR-P7)。
[0043] 表4 GHR基因引物信息
[0044]
[0045] 3)采用PCR擴增試劑盒擴增目標片段；