3p在正常人和骨肉瘤患者血液中的含量。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 以根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí) 驗(yàn)指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或 均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[0037] 實(shí)施例1高通量測序篩選與骨肉瘤相關(guān)的miRNA
[0038] 1、樣本收集
[0039] 5例原發(fā)性骨肉瘤患者及5名正常人。受試者要求空腹至少12h，于次日清晨7:00~ 8 :00室溫下，抽取10ml靜脈血于乙二胺四乙酸（EDTA)抗凝管，提取外周血單個(gè)核細(xì)胞 PBMCs，加入lml Trizol試劑（Invitrogen公司），充分混勾，-80°C保存標(biāo)本，以用于RNA提 取。所有的血樣和病理結(jié)果應(yīng)真實(shí)可靠，研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。
[0040] 2、血液單核細(xì)胞RNA提取
[0041 ]將步驟（1)中的細(xì)胞融化，加入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右， 室溫下靜置5分鐘。4°C，12,000rpm離心15分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清液入新的1.5ml離心管，加入 等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4°C，12000rpm離心10分鐘后，去上清，向 沉淀中加入2/5體積的70%乙醇，4°C，12000rpm離心洗滌沉淀5分鐘。去上清，將沉淀室溫晾 干后加入適量無 RNA酶的水充分溶解，測定0D260和0D280值。采用無 RNA酶的DNA酶I處理， QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，詳細(xì)操作原理和方法見試劑盒說明書。
[0042] 3、RNA樣品的純度分析
[0043] NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測RNA樣品，樣品純度要求:0D260/280S1.8。
[0044] 4、RNA樣品的質(zhì)量分析（Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)
[0045] Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和 18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整性指數(shù)合格、濃度達(dá)到要求的符合RNA-seq測序cDNA文 庫構(gòu)建的要求，可以用于文庫構(gòu)建及測序。28S/18S g 1; RNA完整性:RIN值^ 7.0。
[0046] 5、sRNA文庫構(gòu)建
[0047] 實(shí)驗(yàn)采用Illumina TruSeq Small RNA試劑盒構(gòu)建文庫，在總RNA中回收長度18-30nt RNA，通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成單鍵cDNA，cDNA擴(kuò)增后，回收cDNA產(chǎn)物，建成小RNAs文庫。 [0048] 6、測序
[0049] 運(yùn)用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量測序技術(shù)對(duì)miRNA進(jìn)行測序，通過去 接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。
[0050] 7、結(jié)果分析
[0051]通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)miRNA原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正后進(jìn)行t-test得到P值， 然后利用Fisher檢驗(yàn)合并P值，篩選差異表達(dá)miRNA。設(shè)定P值<0.01，共篩選出7個(gè)差異表達(dá) 的miRNA，其中表達(dá)水平上調(diào)的miRNA3個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的miRNA4個(gè)。如圖1所示，miR-4714-3p在正常人和骨肉瘤患者中存在差異表達(dá)，在骨肉瘤患者血液中miR-4714-3p的水平顯著 升高(Ρ<0·05)。
[0052] 實(shí)施例2 QPCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miR-4714-3p
[0053] 1、根據(jù)實(shí)施例1中高通量測序結(jié)果選擇miR-4714-3p進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí) 施例1中的樣本收集方式選擇正常人和骨肉瘤患者各50例，進(jìn)行血液單核細(xì)胞的分離與保 存。
[0054] 2、RNA提取過程同實(shí)施例1。
[0055] 3、逆轉(zhuǎn)錄：將 10pg-lyg 的總 RNA 模板與 2μ1 10* 緩沖液、2μ1 dATP(10mM)、0.5yl polyA多聚酶、Ο·5μ1核糖核酸酶(RNase)抑制劑和無核糖核酸酶水(RNase free water)混 合，體積最后為20yl，37°C孵育lh。然后反應(yīng)管中加入ΙμL 0.5ygAU Oligo(dT)特異性RT引 物，70°C孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打斷RNA和引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。最后，將上述20μ1 反應(yīng)混合物與4μ1 5*緩沖液、ΙμL dNTP(10mM)，0.5yl M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5μ1核糖核酸酶 (RNase)抑制劑，10μ1 polyA反應(yīng)混合液和4μ1無核糖核酸酶水(RNase free water)混合， 42°C孵育 lh。
[005?] 4、QPCR反應(yīng):采用25μ1反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù) 三次以上以保證結(jié)果的可靠性。配制以下反應(yīng)體系：SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μ 1，正向引物(5μΜ/μ1)1μ1，反向引物(5μΜ/μ1)1μ1，模板cDNA 2.0μ1，無酶水8.5μ1。各項(xiàng)操作 均于冰上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?95°(31〇111丨11，（95°(3158,60°〇558)*45個(gè)循環(huán)。以5￥81?6^611作為 熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增miR-4714-3p的正向 引物序列為：5'-CCAACCTAGGTGGTCAGAGTTG-3'（SEQ ID N0.1)，反向引物為通用反向引物 (購自北京曠博生物技術(shù)有限公司）。以snRNA U6作為參照基因，其上游引物序列為：5'_ CTCGCTTCGGCAGCACA-3 '（ SEQ ID N0 · 2);下游引物序列為：5 ' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ' (SEQ ID N0.3)。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Δ ACT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0057] 5、結(jié)果
[0058]如圖2所示，與正常人相比，骨肉瘤患者血液中miR-4714-3p的表達(dá)水平顯著升高， 與高通量測序結(jié)果一致(P<〇. 05)。
[0059] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 微小RNA在制備骨肉瘤診斷工具中的應(yīng)用，其特征在于，所述微小RNA選自以下組:初 始miRNA、前體miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA;前體 miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA;所述微小RNA是miR-4714-3p。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述微小RNA是成熟miR-4714-3p。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷工具包括檢測樣本中權(quán)利要求1 所述的微小RNA表達(dá)水平的試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述樣本的來源包括血液、尿液、淚液、唾 液、組織液、腦脊液、汗液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷工具包括試劑盒、芯 片、試紙、或高通量測序平臺(tái)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包括針對(duì)權(quán)利要求1所述的微 小RNA的引物和/或探針;所述芯片包括固相載體，以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸 探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1所述的微小RNA的部分或全部序 列;所述試紙包括針對(duì)權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針;所述高通量測序平臺(tái)包 括針對(duì)權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針。7. -種骨肉瘤的診斷工具，其特征在于，所述診斷工具包括檢測樣本中權(quán)利要求1所述 的微小RNA表達(dá)水平的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷工具，其特征在于，所述樣本的來源包括血液、尿液、淚 液、唾液、組織液、腦脊液、汗液。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷工具，其特征在于，所述診斷工具包括試劑盒、芯片、試 紙、或高通量測序平臺(tái)。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷工具，其特征在于，所述試劑盒包括針對(duì)權(quán)利要求1所述 的微小RNA的引物和/或探針;所述芯片包括固相載體，以及固定在所述固相載體上的寡核 苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對(duì)應(yīng)于權(quán)利要求1所述的微小RNA的部分或全部 序列;所述試紙包括針對(duì)權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針;所述高通量測序平臺(tái) 包括針對(duì)權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針。
【專利摘要】本發(fā)明公開了miR-4714-3p作為骨肉瘤診斷標(biāo)志物的用途。本發(fā)明通過高通量測序和QPCR實(shí)驗(yàn)證明miR-4714-3p在正常人和骨肉瘤患者血液中的含量存在顯著差異，因此認(rèn)為miR-4714-3p可以作為診斷骨肉瘤的分子標(biāo)志物以用于開發(fā)診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，該診斷產(chǎn)品具有以下優(yōu)勢：無創(chuàng)、快速、靈敏，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105441565
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610003305
【發(fā)明人】楊祚璋, 張瞾昕, 夏俊峰, 李惠玲, 張婭, 李素
【申請(qǐng)人】楊祚璋
【公開日】2016年3月30日
【申請(qǐng)日】2016年1月4日