褐色橘蚜基因功能驗(yàn)證的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及昆蟲的生長發(fā)育調(diào)控和基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種褐色橘蚜基因功 能驗(yàn)證的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 褐色橘姐(Toxoptera citricida)是一種世界性的柑橘害蟲，同時(shí)是柑橘衰退病 病毒的主要傳播媒介，對柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)影響較大，目前化學(xué)防治仍是控制褐色橘蚜的重 要措施?；瘜W(xué)農(nóng)藥施用不當(dāng)，不僅影響果品安全，同時(shí)還會導(dǎo)致嚴(yán)重的抗藥性。
[0003] RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默手段，是指 在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(dsRNA)誘發(fā)的、同源RNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是 通過dsRNA的介導(dǎo)特異性的降解對應(yīng)序列的mRNA。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性抑制特定 基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和基因治療領(lǐng)域。同時(shí)，在農(nóng)業(yè)害蟲基 因功能的研究中，通過微量注射以及飼喂含有dsRNA的人工飼料是目前用于導(dǎo)入dsRNA最主 要的兩種方法。然而，相比于一般昆蟲個(gè)體更小的褐色橘蚜，如果想用微量注射的方法導(dǎo)入 dsRNA難度較大，目前還沒有對褐色橘蚜導(dǎo)入dsRNA方面的報(bào)道。為了滿足方便地研究褐色 橘蚜基因功能的需要，特別是為探索新的褐色橘蚜控制的有效方法，需要更好的褐色橘蚜 dsRNA導(dǎo)入的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種褐色橘蚜基因功 能驗(yàn)證的方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種褐色橘蚜基因功能驗(yàn)證的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)準(zhǔn)備目的基因 dsRNA溶液:根據(jù)要抑制的目的基因合成相應(yīng)的dsRNA溶液；
[0008] 2)將步驟1)中的dsRNA溶液導(dǎo)入褐色橘蚜，操作方法包括如下步驟：
[0009] a、取離心管，將離心管的底部剪去使得底部敞口，另取PCR管將管底剪掉使得底部 敞口，將PCR管的管底與離心管管蓋的內(nèi)壁粘在一起，使得PCR管套在離心管內(nèi)；
[0010] b、在PCR管中注入步驟1)制得的dsRNA溶液，將離心管管底朝上地豎立放置；
[0011] c、取新鮮的柑橘嫩梢，插入PCR管中；
[0012] d、將褐色橘蚜挑入離心管中，用紗網(wǎng)蓋住離心管的管底，防止褐色橘蚜逃出離心 管，然后將離心管放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48_72h。
[0013] 3)培養(yǎng)結(jié)束后，收集褐色橘蚜蟲體提取RNA，檢測步驟1中的目的基因的表達(dá)情況。
[0014] 作為優(yōu)選地，所述的紗網(wǎng)為80目紗網(wǎng)。
[0015] 作為優(yōu)選地，所述的離心管為50mL離心管，所述的PCR管為250μ1 PCR管;步驟2)中 所述步驟d中，每個(gè)離心管中的褐色橘蚜頭數(shù)為20 - 30頭。
[0016] 作為優(yōu)選地，步驟2)中所述步驟d中，培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件為25 ± 1°C、濕度75 土 5%、光照：黑暗為 12-14h:10-12h。
[0017] 作為優(yōu)選地，步驟3)中所述檢測目的基因的表達(dá)情況的方法為：收集褐色橘蚜蟲 體提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，然后以cDNA為模板利用qRT-PCR技術(shù)檢測目的基因的 相對表達(dá)量驗(yàn)證抑制情況。
[0018] 上述技術(shù)方案中，步驟1)中所述目的基因?yàn)楹稚俳鉇BCG4基因，按照如下步驟制 備該基因的dsRNA溶液：
[0019] 1)提取褐色橘蚜的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，利用上下游引物T7-ABCG4-S1和T7-ABCG4-A1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物序列為：
[0020] T7-ABCG4-S1：
[0021 ] TAATACGACTCACTATAGGGATGGGAAGTGTTTAACATG；
[0022] T7-ABCG4-A1：
[0023] TAATACGACTCACTATAGGGACATGCCAAATCTATTCCA。
[0024] 2)將步驟1中的PCR產(chǎn)物回收純化之后作為合成dsRNA的轉(zhuǎn)錄模板，合成純化得到 褐色橘姐ABCG4基因的dsRNA溶液。
[0025]上述技術(shù)方案中，步驟1)中所述目的基因?yàn)閹锥≠|(zhì)合成酶基因，按照如下步驟制 備該基因的dsRNA溶液：
[0026] 1)提取褐色橘蚜的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，利用上下游引物T7- CHS-S1和T7-CHS-A1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物序列為：
[0027] T7-CHS-S1：
[0028] TAATACGACTCACTATAGGGAGACGTAAAAACTGAAGAC；
[0029] T7-CHS-A1：
[0030] TAATACGACTCACTATAGGGCGTCCATGAAAATGTGAGT。
[0031] 2)將步驟1中的PCR產(chǎn)物回收純化之后作為合成dsRNA的轉(zhuǎn)錄模板，合成純化得到 褐色橘蚜幾丁質(zhì)合成酶基因的dsRNA溶液。
[0032]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明方法設(shè)計(jì)新穎、操作簡單、基因沉默效率高，基因干 擾后有明顯表型變化，研究應(yīng)用成本低，解決了褐色橘蚜目前沒有有效的dsRNA導(dǎo)入方法的 問題，能夠穩(wěn)定而且有效地對褐色橘蚜進(jìn)行RNA干擾，通過RNA干擾之后觀察其表型，可以對 褐色橘蚜目標(biāo)基因所預(yù)測功能進(jìn)行驗(yàn)證，探索研究新的害蟲控制方法。本發(fā)明方法適用范 圍廣，只需要根據(jù)不同目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物得到不同基因的dsRNA，均可以通過本發(fā)明 方法將相應(yīng)的dsRNA導(dǎo)入褐色橘蚜，該方法還可廣泛應(yīng)用于與褐色橘蚜個(gè)體類似大小的其 他蚜蟲。
【附圖說明】
[0033]圖1為本發(fā)明的飼喂dsRNA的裝置。
[0034] 圖2為褐色橘蚜飼喂ABCG4基因的dsRNA后的ABCG4基因相對表達(dá)量，其中GFP表示 對照組，dsABCG4表示實(shí)驗(yàn)組。
[0035] 圖3為褐色橘蚜飼喂ABCG4基因的dsRNA后表型表現(xiàn)圖；其中1為對照組的正常褐色 橘蚜，2為實(shí)驗(yàn)組的翅發(fā)育不正常的褐色橘蚜。
[0036] 圖4為褐色橘蚜飼喂CHS基因的dsRNA后的CHS基因相對表達(dá)量，其中roS表示對照 組，dsTCiCHS表示實(shí)驗(yàn)組。
[0037]圖5為褐色橘蚜飼喂CHS基因的dsRNA后的累積蛻皮率，其中PBS表示對照組， dsTCiCHS表示實(shí)驗(yàn)組。
[0038] 圖6為褐色橘蚜飼喂CHS基因的dsRNA后的累積死亡率，其中PBS表示對照組， dsTCiCHS表示實(shí)驗(yàn)組。
[0039]圖7為褐色橘蚜飼喂CHS基因的dsRNA后表型表現(xiàn)圖；其中1為實(shí)驗(yàn)組的不能正常蛻 皮死亡的褐色橘蚜，2為對照組的能夠正常蛻皮的褐色橘蚜。
【具體實(shí)施方式】
[0040]本發(fā)明實(shí)施例所用化學(xué)試劑來源如下：
[0041 ] RNeasy Plus Micro Kit(QIAGEN公司，德國）
[0042] PrimeSTAR Max Premix(Takara公司，日本）
[0043] 膠回收純化試劑盒(Takara公司，日本）
[0044] Transcript Aid T7 High Yield Transcription Kit(Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0045] Perfect real time RT reagent(Takara公司，日本）
[0046] G〇Taq_?qPCR Master Mix(Promega公司，美國）
[0047] TranscriptAid Enzyme Mix(Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0048] ATP/CTP/GTP/uTP Mix(Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0049] PrimeScriptRT Enzyme Mix I (Thermo fisher Scientific 公司，美國）
[0050] Oligo dT Primer(The;rmo fisher Scientific公司，美國）
[0051] Random 6 mers(Thermo fisher Scientific公司，美國）
[0052] 實(shí)施例一、褐色橘姐ABCG4基因功能驗(yàn)證
[0053]針對褐色橘姐ABCG4基因功能驗(yàn)證的方法，按照如下步驟操作：
[0054] 一、dsRNA 的合成：
[0055] 1)根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的褐色橘姐ABCG4(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）基因的cDNA序列（西南大學(xué) 昆蟲學(xué)與害蟲控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），設(shè)計(jì)含有T7啟動子的ABCG4基因特異性引物，合成引 物，上下游引物序列分別為：
[0056] T7-ABCG4-S1：
[0057] TAATACGACTCACTATAGGGATGGGAAGTGTTTAACATG；
[0058] T7-ABCG4-A1：
[0059] TAATACGACTCACTATAGGGACATGCCAAATCTATTCCA。
[0060] 2)利用RNA提取試劑盒RNeasy Plus Micro Kit按照使用說明提取褐色橘蚜的總 RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Perfect real time RT reagent按照使用說明將lyg總RNA反 轉(zhuǎn)錄成為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20μ1，其中包括：total RNA ΙμL(約lyg)，5XPrimeScript Buffer 4μ1,PrimeScriptRT Enzyme Mix I ΙμL,Oligo dT Primer(50yM)ΙμL,Random 6 mers(100yM)lyl，RNase Free ddH2〇 12μ1。
[0061 ] 3)對步驟2)得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性3min;95°C變性 30s、60°C退火10s、72°C延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72°C條件下延伸10min;PCR反應(yīng)體系共25μ 1，包括：濃度為lOOOng/μΙ的cDNA模板Ο . 5μ1，濃度為Ο . 15-0.25μΜ的上、下游引物（T7-ABCG4-S1、T7-ABCG4-A1)各lyl，PrimeSTAR Max Premix 12·5μ1 以及去核酸酶水ΙΟμΙ。
[0062] 4)將步驟3)中的PCR產(chǎn)物用膠回收純化試劑盒按照說明書純化回收之后作為合成 dsRNA的轉(zhuǎn)錄模板，用體外合成RNA試劑盒Transcript Aid T7 High Yield Transcription K i t按照使用說明轉(zhuǎn)錄合成并純化得到褐色橘蚜ABCG4基因的dsRNA溶液，將dsRNA溶液濃度 稀釋到200-300ngAU dsRNA合成反應(yīng)體系為20μ1，其中包括：cDNA模板4μ1 (約lyg)、5 X TranscrptAid Reaction Buffer4yl、濃度為 100mM的ATP/CTP/GTP/MTP Mix 8μ1、 TranscriptAid Enzyme Mix2yl和DEPC-treated water 2μ1;反應(yīng)條件為：37°C孵育4h。
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