一種檢測(cè)診斷主動(dòng)脈夾層病致病基因的dna文庫(kù)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過(guò)靶向高通量半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)檢測(cè)診斷主動(dòng)脈夾層致病基因 的DNA文庫(kù)及其應(yīng)用。具體說(shuō)是根據(jù)主動(dòng)脈夾層致病基因，設(shè)計(jì)能覆蓋上述基因外顯子及毗 鄰區(qū)域的超多重PCR引物，并對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行超多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用高通量測(cè) 序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，尋找致病突變，明確主動(dòng)脈夾層的遺傳學(xué)病因，為臨床診斷提供遺傳學(xué)和 分子生物學(xué)的理論依據(jù)，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域臨床檢測(cè)技術(shù)中的基因檢測(cè)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 主動(dòng)脈夾層是心血管系統(tǒng)較常見(jiàn)的一種嚴(yán)重威脅患者生命安全的主動(dòng)脈疾病，起 病急，預(yù)后差，死亡率高，病因復(fù)雜，日益受到人們的重視。目前，針對(duì)該病尚無(wú)治療效果滿(mǎn) 意的特異性藥物，因此能否早期篩查診斷出潛在患病人群對(duì)于該病的防治就顯得至關(guān)重 要。
[0003] 傳統(tǒng)的主動(dòng)脈夾層診斷主要依靠臨床表現(xiàn)（突發(fā)撕裂樣劇烈胸痛或腰腹痛)和傳 統(tǒng)生物標(biāo)記物(平滑肌肌球蛋白重鏈smMHC、f丐調(diào)蛋白calpon in、彈力蛋白降解產(chǎn)物sELAF、C 反應(yīng)蛋白CRP、DD二聚體D-Dimer)和影像學(xué)檢查(經(jīng)食管超聲心電圖、主動(dòng)脈超聲、主動(dòng)脈CT 及核磁共振）。然而，臨床上由于主動(dòng)脈夾層患者出現(xiàn)臨床癥狀的時(shí)間差異大，很多患者甚 至沒(méi)有明顯的胸痛和腰腹痛，首發(fā)癥狀即為猝死。傳統(tǒng)生物標(biāo)記物預(yù)測(cè)和診斷主動(dòng)脈夾層 特異性差。傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查診斷方法存在確診時(shí)間晚（癥狀出現(xiàn)后），難以判斷預(yù)后等問(wèn) 題。
[0004] 主動(dòng)脈夾層既可以獨(dú)立發(fā)病，也可以作為臨床綜合征的一種表現(xiàn)。與主動(dòng)脈夾層 相關(guān)的臨床綜合征有:Marfan綜合征(MFS)、Ehlers_Danlos綜合征(EDS)、Loeys_Dietz綜合 征(LDS)以及主動(dòng)脈扭曲綜合征(ATS)。
[0005] 隨著測(cè)序技術(shù)近年來(lái)的迅猛發(fā)展，人類(lèi)基因檢測(cè)方法變得越來(lái)越簡(jiǎn)單快捷，檢測(cè) 成本也日益下降，使得基因診斷應(yīng)用在臨床一線(xiàn)的常規(guī)檢查中成為可能。而且，基因診斷敏 感性高，能早期診斷，即：可在癥狀出現(xiàn)前和不可逆病理改變前做出診斷，臨床醫(yī)生也可以 根據(jù)基因型判斷惡性臨床轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，早期干預(yù)。在各種高通量測(cè)序平臺(tái)中，新進(jìn)出現(xiàn)的基 于半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)的擴(kuò)增子測(cè)序以其快速的運(yùn)行時(shí)間，靈活的通量選擇，較低的運(yùn)行成本 和相對(duì)簡(jiǎn)單的操作方法脫穎而出。
[0006] 因此，有必要尋求一種新的基于高通量半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)的檢測(cè)主動(dòng)脈夾層致病基 因突變的方法，提高診斷準(zhǔn)確率，降低成本和勞動(dòng)強(qiáng)度并提高時(shí)效性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種覆蓋包括：家族性主動(dòng)脈瘤或夾層(FTAAD)、 Marfan綜合征(MFS)、Ehlers_Danlos綜合征(EDS)、Loeys_Dietz綜合征(LDS)以及主動(dòng)脈扭 曲綜合征(ATS)等多種常見(jiàn)主動(dòng)脈夾層相關(guān)疾病，包含33個(gè)主動(dòng)脈夾層致病相關(guān)基因的DNA 文庫(kù)。本發(fā)明是目前已知檢測(cè)主動(dòng)脈夾層最全面的靶向測(cè)序基因檢測(cè)試劑盒，33個(gè)基因的 選擇基于國(guó)際已報(bào)道和公認(rèn)的臨床致病基因數(shù)據(jù)庫(kù)(0M頂數(shù)據(jù)庫(kù)、HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)、Cl inVar數(shù) 據(jù)庫(kù)）以及發(fā)明者自己的課題研究?jī)?nèi)容。這33個(gè)基因上的致病突變既可以單獨(dú)致病，也可以 聯(lián)合致病導(dǎo)致更加嚴(yán)重和復(fù)雜的臨床表型，本發(fā)明首次做到可以一次性全面的對(duì)它們進(jìn)行 測(cè)序。其中33個(gè)基因及其導(dǎo)致的相關(guān)疾病如下：
[0008]
[0009]
[0010] 本發(fā)明根據(jù)33個(gè)主動(dòng)脈夾層致病基因，設(shè)計(jì)能覆蓋上述基因外顯子及毗鄰調(diào)控區(qū) 域的適用于超多重PCR的引物池，進(jìn)而對(duì)樣本基因組DNA進(jìn)行超多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用 高通量半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，尋找致病突變，明確主動(dòng)脈夾層的遺傳學(xué)病因，為臨床診 斷提供遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論依據(jù)。為此，本發(fā)明還提供以下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明還提供一種上述DNA文庫(kù)在制備診斷試劑盒中的應(yīng)用，所述試劑盒用于診 斷主動(dòng)脈夾層。
[0012] 本發(fā)明還提供一種上述DNA文庫(kù)在制備診斷裝置中的應(yīng)用，所述診斷裝置用于診 斷主動(dòng)脈夾層。優(yōu)選的，所述診斷裝置是測(cè)序芯片。
[0013] 進(jìn)一步，所述應(yīng)用包括下列步驟：
[0014] (1)提供受試者樣本的基因組DNA;
[0015] (2)利用上述的DNA文庫(kù)從Ion Torrent?高通量測(cè)序平臺(tái)自動(dòng)合成覆蓋全部33個(gè) 致病基因的擴(kuò)增引物文庫(kù)，對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行超多重PCR擴(kuò)增；
[0016] ⑶對(duì)步驟⑵得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切；
[0017] (4)對(duì)步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物加 Barcode接頭;優(yōu)選的，所述Barcode接頭來(lái)自于 高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒；
[0018] (5)對(duì)步驟(4)得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0019] (6)對(duì)步驟(5)得到的純化產(chǎn)物用通用引物進(jìn)行二次擴(kuò)增;優(yōu)選的，該通用引物來(lái) 自于高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒；
[0020] (7)對(duì)步驟(6)得到的二次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段選擇及濃度測(cè)定，即建成患者目標(biāo)區(qū) 域擴(kuò)增文庫(kù)；
[0021 ] (8)對(duì)步驟(7)所得到的文庫(kù)經(jīng)過(guò)油包水PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，將待測(cè)序目的片段連接 于ISP珠子，得到反應(yīng)液；
[0022] (9)將步驟(8)得到的包含ISP珠子的反應(yīng)液點(diǎn)入芯片，上Ion Torrent?高通量測(cè) 序進(jìn)彳丁測(cè)序；
[0023] (10)將步驟(9)得到的堿基序列信息進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)處理，得到與疾病相關(guān) 的突變位點(diǎn)；
[0024] (11)對(duì)步驟（10)得到的突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序法驗(yàn)證。
[0025]優(yōu)選的，所述樣本來(lái)自受試者的外周血、體液、組織器官樣本。
[0026] 更優(yōu)選的，所述應(yīng)用進(jìn)一步用于指導(dǎo)治療，例如:通過(guò)基因檢測(cè)確診的FBN1基因突 變Marfan綜合征患者，應(yīng)考慮定期行主動(dòng)脈和心臟彩超隨訪(fǎng)，終生口服ARB類(lèi)藥物及倍他受 體阻滯劑等治療，改善預(yù)后。
[0027] 本發(fā)明還提供一種診斷試劑盒，其中，所述試劑盒包括上述包含33個(gè)主動(dòng)脈夾層 的致病基因的DNA文庫(kù)。
[0028] 本發(fā)明還提供一種診斷裝置，其中，所述裝置包括上述包含33個(gè)主動(dòng)脈夾層的致 病基因的DNA文庫(kù)。優(yōu)選的，所述裝置為測(cè)序芯片。
[0029] 本發(fā)明提供一種使用上述DNA文庫(kù)、診斷試劑盒或診斷裝置對(duì)患者進(jìn)行診斷的方 法，所述方法包括下列步驟：
[0030] (1)提供受試者樣本的基因組DNA;
[00311 (2)利用上述的DNA文庫(kù)從Ion Torrent?高通量測(cè)序平臺(tái)自動(dòng)合成覆蓋全部31個(gè) 致病基因的擴(kuò)增引物文庫(kù)，對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行超多重PCR擴(kuò)增；
[0032] (3)對(duì)步驟(2)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切；
[0033] (4)對(duì)步驟(3)得到的酶切產(chǎn)物加 Barcode接頭;優(yōu)選的，所述Barcode接頭來(lái)自于 高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒；
[0034] (5)對(duì)步驟(4)得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0035] (6)對(duì)步驟(5)得到的純化產(chǎn)物用通用引物進(jìn)行二次擴(kuò)增，優(yōu)選的，該通用引物來(lái) 自于高通量測(cè)序建庫(kù)試劑盒；
[0036] (7)對(duì)步驟(6)得到的二次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行片段選擇及濃度測(cè)定，即建成患者目標(biāo)區(qū) 域擴(kuò)增文庫(kù)；
[0037] (8)對(duì)步驟(7)所得到的文庫(kù)經(jīng)過(guò)油包水PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，將待測(cè)序目的片段連接 于ISP珠子，得到反應(yīng)液；
[0038] (9)將步驟(8)得到的包含ISP珠子的反應(yīng)液點(diǎn)入芯片，上Ion Torrent?高通量測(cè) 序進(jìn)彳丁測(cè)序；
[0039] (10)將步驟(9)得到的堿基序列信息進(jìn)行生物信息學(xué)比對(duì)處理，得到與疾病相關(guān) 的突變位點(diǎn)；
[0040] (11)對(duì)步驟(10)得到的突