對血漿游離dna進行多目標位點擴增建庫的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種針對血漿游離DNA或短片段（〈 300bp )DNA的多位點擴增文庫的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來發(fā)現(xiàn)人體的外周血血漿中存在游離的DNA片段，長度在100-300bp，主要集 中在150bp附近。在腫瘤病人中這些游離的DNA可能包括來自脫落和死亡的腫瘤細胞，在孕 婦體內(nèi)可能包括胎兒的DNA片段。因而通過檢測游離DNA片段中的特定位點的突變情況一定 程度上可以反映腫瘤或胎兒的特定位點的變異狀況。但是血漿中的游離DNA片段較短，絕大 部分在150-200bp左右，一般不會超過300bp，而且含量很低。現(xiàn)有的游離血漿DNA提取方法 的提取率一般在lOng/ml血液，而lng游離人體DNA約含150-300份基因組拷貝，再加上血漿 游離DNA來源多樣，還有大量正常細胞或母體來源的DNA，導(dǎo)致需要檢測的突變DNA所占比例 很低。近來迅速發(fā)展的高通量測序技術(shù)通過對大量序列的高覆蓋測序一定程度上可以計算 出這些突變所占的比例。但是現(xiàn)有的二代高通量測序技術(shù)都首先需要對DNA進行文庫構(gòu)建， 在兩側(cè)加上測序使用的接頭，而且如果對所有的DNA片段進行測序則成本過高而且會導(dǎo)致 目標區(qū)段的覆蓋層數(shù)大大降低。這就需要我們有一種方法能對低含量的短片段DNA進行建 庫，并特異性的富集或擴增突變位點所在的區(qū)段，而且可以同時檢測多個位點的文庫構(gòu)建 方法。目前已有的建庫方法包括：1)首先對所有DNA片段進行建庫，然后使用特異性捕獲探 針捕獲突變區(qū)段所在的文庫片段（目前安捷倫的SureSelect Target Enrichment技術(shù)和羅 氏的NimbleGen方法都是這類技術(shù)的代表）；2)使用多重PCR方法進行擴增建庫(如Life公司 的Ion Ampliseq和Illumina的TruSeq Amplicon就屬于這類技術(shù)的代表）。其中特異性捕獲 探針的方式對DNA起始量有一定的要求，而且過程需要進行雜交，周期較長(一般需要24小 時以上），成本較高，且存在較為一定的脫靶問題(捕獲區(qū)段不是目標區(qū)段）。而現(xiàn)有的多重 PCR方法均使用雙端特異性引物的方式，也存在許多問題，因為多重PCR需要設(shè)計特異性引 物，而一個位點至少需要設(shè)計一對特異性引物，同時要考慮多重PCR多個位點的引物之間的 干擾所以設(shè)計引物通常較長(通常30bp左右），且通常距離突變位點有一定距離。但是由于 片段較短，且突變位點可能位于片段末端，導(dǎo)致采用雙端特異性引物實際能結(jié)合的部位過 短，導(dǎo)致大量(超過50%)的片段都無法有效的擴增，從而大大提高了對DNA起始量要求，甚 至無法有效建庫。因而本領(lǐng)域仍需一種可適用于血漿游離DNA這種低當量(<10ng)短片段(〈 300bp)DNA的可對多位點快速擴增富集的建庫方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種對血漿游離DNA等短片段DNA進行多目標位 點擴增建庫的方法，本發(fā)明鑒于現(xiàn)有多重PCR對于引物設(shè)計和DNA片段的缺陷，所提供的建 庫方法不僅可以大幅降低引物設(shè)計和DNA起始量要求而且可以提高文庫擴增效率。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建 庫的方法，依次包括以下步驟：
[0005] 1)、末端修復(fù)和加 A:
[0006] 從而獲得末端加 A的DNA片段；
[0007] 2)、接頭連接：
[0008] 包括在步驟1)所得的末端加 A的DNA片段中加入已退火形成環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)的接頭 DNA，從而獲得兩側(cè)結(jié)合上環(huán)狀發(fā)夾接頭后的雙鏈DNA(簡稱加好接頭的DNA);
[0009] 所述環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)的接頭DNA由環(huán)狀接頭序列、兩側(cè)互補序列構(gòu)建而成（還包括6 個堿基的隨機序列）；
[0010]當步驟1)中提取純化的血衆(zhòng)游離DNA的量< 10ng時，進行下述步驟3);
[0011] 反之，當步驟1)中提取純化的血衆(zhòng)游離DNA的量>10ng時，直接進行下述步驟4);
[0012] 3 )、在步驟2)所得的加好接頭的DNA中加入特異性引物I、Phi 29酶和緩沖液，在 36 · 8~37 · 2°C (較佳37°C)進行線性擴增0 · 5~3小時；
[0013] 4)、PCR 擴增：
[0014]在步驟2)所得的連接接頭后的DNA中或步驟3)所得的經(jīng)過擴增的DNA中加入特異 性引物II和通用引物以及帶有index的測序接頭引物P5和P7,進行14~30輪PCR循環(huán)擴增， 獲得擴增產(chǎn)物，所述擴增產(chǎn)物構(gòu)成所述游離DNA突變位點富集測序文庫。
[0015] 備注:所有反應(yīng)均在同一反應(yīng)管中，無需進行轉(zhuǎn)移和純化。
[0016] 作為本發(fā)明的對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫的方法的改進：
[0017] 該方法還包括步驟5)的文庫檢測。
[0018] 作為本發(fā)明的對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫的方法的進一步改進：
[0019] 所述步驟1)為:使用NEB(New England Biolabs，紐英倫）的末端修復(fù)和加 A模塊（ NEBNext? Ultra? II End Repair/dA-Tailing Module(E7546))對提取純化的血衆(zhòng)游離 DNA進行末端修復(fù)和加 A，從而獲得末端加 A的DNA片段。
[0020] 作為本發(fā)明的對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫的方法的進一步改進:所 述步驟2)為：
[0021] 在步驟1)所得的末端加 A的DNA片段中加入已退火形成環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)的接頭DNA， 以及NEB快速連接模塊[NEBNext? Ultra? II Ligation Module(E7595)]，最終獲得兩側(cè) 結(jié)合上環(huán)狀發(fā)夾接頭后的雙鏈DNA(簡稱加好接頭的DNA)，其中包含的連接酶可對游離DNA 或福爾馬林固定后的DNA片段的損傷進行修復(fù)。
[0022] 作為本發(fā)明的對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫的方法的進一步改進:所 述步驟4)為:步驟3)或步驟2)的所得物通過使用單側(cè)特異性擴增引物結(jié)合另一側(cè)的通用接 頭引物進行特異性PCR并通過高通量測序比對后判斷是否存在突變的方法。
[0023] 作為本發(fā)明的對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫的方法的進一步改進:環(huán) 狀發(fā)卡接頭序列為:ΡΗ0- CTACTTGCCTCGACATCCAGCGTGCGGACACATAACGCACTACATCATTCCGTACTCNNNNNNCGAGGCAAGTAGT。
[0024] 作為本發(fā)明的對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫的方法的進一步改進:特 異性引物I為特異性擴增引物l_EGFR_p. G598V、特異性擴增引物l_EGFR_p. D761Y、特異性擴 增引物l_KRAS_p.Q61K;
[0025] 對應(yīng)的特異性引物II為特異性引物2_EGFR_p.G598V、特異性引物2_EGFR_ p · D761Y、特異性引物2_KRAS_p · Q61K。
[0026] 本發(fā)明的發(fā)明點主要體現(xiàn)為(不僅僅為如下）：
[0027] 1、步驟2)的環(huán)狀接頭序列以及兩側(cè)互補序列的構(gòu)建方法；
[0028] 2、步驟3)的利用單鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)使用Phi29擴增酶以及特異性引物1序列，對原始 DNA樣品進行線性環(huán)狀預(yù)擴增。
[0029] 本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢：
[0030] 1)、只需單向特異性引物，從而解決血漿游離DNA片段短雙側(cè)引物設(shè)計的局限性， 同時可以檢測位于DNA片段首尾處的靶位點。
[0031] 2)、引物設(shè)計簡單，一個靶位點只需要用一條特異性引物II，避免雙側(cè)引物發(fā)生的 引物互補以及錯配。
[0032] 3)、在環(huán)狀發(fā)卡接頭中加入了唯一的barcade，可以評估后續(xù)PCR效率，及時糾正 PCR循環(huán)數(shù)和后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
[0033] 4)、相較于原有的捕獲和簡單多重PCR方法無論是特異性引物設(shè)計還是樣品起始 量要求和實驗操作以及成本都大幅降低。此外單鏈環(huán)化之后也可以進行特異性擴增，從而 使得對DNA的起始要求大大下降。
【附圖說明】
[0034]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0035]圖1為建庫方法示意圖；
[0036]圖2為圖不及引物序列；
[0037]圖3為DNA檢測結(jié)果；
[0038] 左側(cè)為游離DNA提取檢測結(jié)果，右側(cè)為marker，最下方的為250bp，可見DNA均位于 250bp以下；
[0039] 圖4為本方法建庫后PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；
[0040] 左側(cè)為PCR完成后的文庫產(chǎn)物，右側(cè)為marker，最上方的條帶為500bp，下方的2條 亮帶為300和250bp;
[0041 ]圖5為本方法和其他方法對比實驗結(jié)果。
[0042] 從左至右分別為marker，PCR完成后的尿液樣品文庫產(chǎn)物，marker，以及建庫完成 后的腫瘤福爾馬林固定樣品文庫，marker中間亮條帶為500bp，下方的亮帶為300bp。
【具體實施方式】
[0043]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0044]本發(fā)明對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫方法的前置準備步驟：
[0045] 1、選取5ml血衆(zhòng)樣品，使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen 55114)，根據(jù)試劑盒方法提取游離血漿DNA，最終獲得lOOul洗脫體積約lOOng總量游離DNA 片段。為檢測本發(fā)明對低當量DNA的建庫效果，取上述DNA溶液10ul，加水40ul至50ul體積， DNA總量為10ng作為后續(xù)步驟樣品。
[0046] 2、將合成的干粉狀接頭序列，加水溶解，升溫至98°Clmin，自然降溫到室溫，退火 環(huán)狀發(fā)卡接頭序列，并使最終濃度為15uM。
[0047] 3、本實施例對EGFR基因的p.G598V和p.D761Y以及KRAS基因的p.Q61K三個突變位 點進行檢測，合成引物見附表1。
[0048]實施例1、對血漿游離DNA進行多目標位點擴增建庫方法，依次進行以下步驟：
[0049] 1)、末端修復(fù)和加 A
[0050] 按照下表1的配比準備反應(yīng)混合液，用槍輕柔地上下吸吹混勻，使用NEBNext? Ultra? II End Repair/dA-Tailing Module(E7546)包括NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix和NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer兩部分，起始游離DNA量的范 圍在500pg-lug(例如為lOng)。
[0051] 表 1
[0052]
[0053] 放置于PCR儀中，設(shè)置程序反應(yīng)：
[0054] 設(shè)置頂蓋溫度2 75°C
[0055] 20〇C30min
[0056] 65〇C30min