鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的制作方法
【專利說明】鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物
[0001 ] 序列表
[0002] 本申請(qǐng)通過引用并入命名為"250_PCT1. ST25"的文件中的核苷酸序列，該文件大 小為24kb，以IBM-PC機(jī)器格式創(chuàng)建于2014年7月27日，與MS-Windows具有操作系統(tǒng)兼容性， 并隨附提交。
[0003] 相關(guān)申請(qǐng)
[0004] 本申請(qǐng)要求于2013年7月31日提交的題為"SPHINGOLIPID-P OLYALKYLAMINE-0LIG0NUCLE0TIDE COMPOUNDS"的第61/860,274號(hào)美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的權(quán)益，其出于所有目的通 過引用整體并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本文公開了包括鞘脂-聚烷基胺亞磷酰胺在內(nèi)的鞘脂-聚烷基胺基化合物和生成 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的方法、所述鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物、包含所述 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物的藥物組合物及其用于調(diào)芐基因表達(dá)的使用方法。所述寡 核苷酸包括三鏈DNA和單鏈及雙鏈寡核苷酸(包括反義分子），和可用于治療患癌受試者的 RNAi 分子例如雙鏈 DNA(dsDNA)，包括 siRNA、siNA、miRNA、anti-mi!lSsaRNA。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 治療性寡核苷酸(包括雙鏈RNA(dsRNA))在臨床上的應(yīng)用由于缺乏安全有效的遞 送系統(tǒng)而受到阻礙。已使用陽離子脂質(zhì)來遞送治療性寡核苷酸，然而，其使用受限于細(xì)胞毒 性和陽離子脂質(zhì)主要在肝中累積的事實(shí)。
[0008] 國(guó)際專利公開號(hào)TO 2008/104978、W0 2009/044392、W0 2011/066475、W0 2011/ 084193和WO 2011/085056公開了經(jīng)化學(xué)修飾的dsRNA，其通過引用整體并入本文。
[0009] US 6,469，148中提供了用于大規(guī)模制備鞘氨醇的方法，US 7,771，711中公開了鞘 脂-聚烷基胺綴合物;二者均通過引用整體并入本文。
[0010] PCT公開號(hào)W0 2010/150004涉及攜帶脂質(zhì)分子的寡核苷酸及其作為基因表達(dá)抑制 劑的用途。
[0011] 仍然需要具有活性且安全的dsRNA治療劑，其表現(xiàn)出以下中的至少之一:與未經(jīng)修 飾對(duì)應(yīng)物相比增加的細(xì)胞攝取、增強(qiáng)的內(nèi)體釋放、增加的循環(huán)時(shí)間、有利的生物分布、降低 的細(xì)胞毒性和降低的免疫原性，同時(shí)保留治療活性。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 本文提供了含鞘脂-聚烷基胺綴合物的寡核苷酸化合物、所述化合物的制備方法 及可用于生成所述化合物的中間體。本文公開的鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物具有可用 于例如提供與未經(jīng)修飾核酸分子相比以下中的至少一者的結(jié)構(gòu)和修飾:增加的細(xì)胞攝取、 增強(qiáng)的內(nèi)體釋放、增加的循環(huán)時(shí)間、改進(jìn)的生物分布、降低的毒性、降低的免疫原性、降低的 脫靶效應(yīng)(off-target)或增加的載入RISC化合物。鞘脂-聚烷基胺有益地與單鏈或雙鏈核 酸分子相連，并且可在癌癥治療中用作治療劑。
[0014] 在一個(gè)方面，本文提供了含鞘脂-聚烷基胺綴合物的化合物，其具有通式I:
[0015]
[0016] 其中
[001 7] R1是支鏈或直鏈C7-C24烷基、烯基或多烯基；
[0018] R2、R3和R4各自獨(dú)立地為氫、支鏈或直鏈聚烷基胺或其衍生物、核苷酸、寡核苷酸、 偶聯(lián)部分或保護(hù)基團(tuán)；
[0019] R3'是氫、CrC4烷基或保護(hù)基團(tuán)；
[0020] A2、A3和A4各自獨(dú)立地存在或不存在，但若存在則為c(o)、c(o)nhx、c(o)nhr 5x、c (o)r5x、c(o)r5c(o)x、r5x 或 r5oc(o)x;
[0021 ] R5是任選地被一個(gè)或多個(gè)雜原子取代的支鏈或直鏈&-C20烴基鏈；
[0022] X存在或不存在，但若存在則為S、P、0或NH;
[0023] R2、R3或R4中的至少一者為支鏈或直鏈聚烷基胺或其衍生物;并且
[0024] R2、R3或R4中的至少一者為核苷酸、寡核苷酸或偶聯(lián)部分；
[0025] 或者所述化合物的鹽。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，R1是C7-C24烷基、C1Q-C 2Q烷基或C1Q-C16烷基。優(yōu)選地，R1是C13烷 基。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，六2是以0)。在一些實(shí)施方案中，A4是C(0)。在一些實(shí)施方案中， R2是直鏈聚烷基胺或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，R4是直鏈聚烷基胺或其衍生物。優(yōu)選地， 所述直鏈聚烷基胺是亞精胺或精胺。在一些實(shí)施方案中，R 2是亞精胺。在其他實(shí)施方案中，R2 是精胺。在一些實(shí)施方案中，R4是亞精胺。在其他實(shí)施方案中，R4是精胺。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，R3是氫，A2是C(0)，A3不存在，R2是精胺并且在本文中提供為具 有通式(la)的化合物：
[0029]
[0030] 其中
[0031 ] A4 存在或不存在，但若存在則選自由 C(0)、C(0)NHX、C(0)NHR5X、C(0)R5X、C(0)R5C (o)x，、r5x 和 r5oc(o)x 組成的組；
[0032] R3是氫或保護(hù)基團(tuán)；
[0033] R4是核苷酸、寡核苷酸或偶聯(lián)部分；
[0034] R5是任選地被一個(gè)或多個(gè)雜原子取代的支鏈或直鏈&-C20烴基鏈;并且
[0035] 每個(gè)R6獨(dú)立地為氫或保護(hù)基團(tuán)；
[0036] 或者所述化合物的鹽。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，R3是氫，A2是C(0)，A3不存在，R2是亞精胺并且在本文中提供為 具有通式(lb)的化合物：
[0038]
[0039] 其中
[0040] A4 存在或不存在，但若存在則選自由 C(0)、C(0)NHX、C(0)NHR5X、C(0)R5X、C(0)R5C (o)x、r5x 和 r5oc(o)x 組成的組；
[0041] R3是氫或保護(hù)基團(tuán)；
[0042] R4是核苷酸、寡核苷酸或偶聯(lián)部分；
[0043] R5是任選地被一個(gè)或多個(gè)雜原子取代的支鏈或直鏈&-C20烴基鏈;并且
[0044] 每個(gè)R6獨(dú)立地為氫或保護(hù)基團(tuán)；
[0045]或者所述化合物的鹽。
[0046]在通式I、Ia和lb的多種實(shí)施方案中，A4是C(0)NHR5X，其中R4是核苷酸、寡核苷酸或 偶聯(lián)部分。在一些這樣的實(shí)施方案中，R5是C6烴基鏈并且X是0。
[0047]在通式I、Ia和lb的多種實(shí)施方案中，R4是偶聯(lián)部分。偶聯(lián)部分可選自亞磷酰胺;胺 (-NH2);羧基(-C00H)或活化羧基包括NHS酯;巰基(-SH)和二硫鍵(-S-S-)，其還原為巰基； 羰基(-CH0);氰基(-CN)、羥基(-OH)和疊氮化物包括芳基疊氮化物。在一些實(shí)施方案中，R 5 是亞磷酰胺，例如2-氰乙基N，N，N'，N'_四異丙基亞磷酰二胺。在一些實(shí)施方案中，R4是活化 羰基，優(yōu)選NHS酯。
[0048] 在通式I、Ia和lb的多種實(shí)施方案中，R4是2-氰乙基N，N，N'，N'_四異丙基亞磷酰二 胺，并且在本文中提供為具有如下所示通式(Ila)或（lib)的化合物：
[0050]其中，R3和R6各自獨(dú)立地為氫或保護(hù)基團(tuán)。
[0051 ] 在通式I、Ia和lb的多種實(shí)施方案中，A4是C(0)NHR5C(0)X，R4是NHS酯，R 5是C6烷基 鏈，X是〇，并且在本文中提供為具有通式II la或II lb的化合物：
[0052]
[0053] 其中，R3、R3'和R6各自獨(dú)立地為氫或保護(hù)基團(tuán)。
[0054] 在以上公開的任意通式的多種實(shí)施方案中，R4是寡核苷酸。所述寡核苷酸是單鏈 寡核苷酸或雙鏈寡核苷酸，其可以被部分或完全化學(xué)修飾。
[0055] 所述單鏈寡核苷酸為例如選自由以下組成之組的反義分子:反義DNA、反義RNA、反 義DNA/RNA嵌合體、外顯子跳躍分子、an t i -mi R、aRNA、適體、合成mRNA、IncRNA和shRNA。在一 些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是雙鏈核酸(dsNA)分子。所述雙鏈寡核苷酸為例如dsRNA，如 s iRNA、miRNA 或 miRNA 模擬物。
[0056] 在所述方法、用于使用的化合物或用途的一些實(shí)施方案中，經(jīng)化學(xué)修飾的dsNA分 子包含：
[0057] a.具有5 '端和3 '端的8至49個(gè)核苷酸的有義鏈；
[0058] b.長(zhǎng)度為15至49個(gè)核苷酸的反義鏈，并且每條鏈均具有5 '端和3 '端；
[0059] c.反義鏈的15至49個(gè)核苷酸序列與靶基因 RNA的連續(xù)序列互補(bǔ)；
[0060] d.有義鏈的8至49個(gè)核苷酸序列與反義鏈互補(bǔ)。
[0061 ]在一些實(shí)施方案中，反義鏈與有義鏈不對(duì)稱，例如，有義鏈的長(zhǎng)度為8至14個(gè)核苷 酸，而反義鏈的長(zhǎng)度為15至23個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，反義鏈和有義鏈的長(zhǎng)度各自獨(dú) 立地為19至23個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，反義鏈與有義鏈的長(zhǎng)度相同。在一些實(shí)施方案 中，反義鏈和有義鏈的長(zhǎng)度為19至23個(gè)核苷酸，優(yōu)選19個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，有義 鏈包含兩組或更多組共價(jià)連接但并非通過共價(jià)鍵(即，有義鏈?zhǔn)?帶切口"）相連的連續(xù)核苷 酸。
[0062] 在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸分子是具有如下結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA(dsRNA):
[0063] 5'（N)x-Z33(反義鏈）
[0064] 3'Z'-(N'）y_z"5'（有義鏈）
[0065]其中，N和Ν'各自為未經(jīng)修飾核糖核苷酸、經(jīng)修飾核糖核苷酸或非常規(guī)部分；
[0066] 其中，（Ν)χ和(Ν'）y分別為寡核苷酸，其中每個(gè)連續(xù)的Ν或Ν'通過共價(jià)鍵與下一Ν或 Ν'相連；
[0067] 其中，X和y各自獨(dú)立地為15至49之間的整數(shù)；
[0068] 其中，z"存在或不存在，但若存在則為與有義鏈的5 '端共價(jià)連接的封端部分；
[0069]其中，Z和Z '各自獨(dú)立地存在或不存在，但若存在則為1至5個(gè)連續(xù)核苷酸或非核苷 酸部分或在其所在鏈之3 '端共價(jià)連接的其組合；
[0070] 其中，鞘脂-聚烷基胺綴合物與反義鏈的3'端、有義鏈的3'端或有義鏈的5'端中的 至少一者共價(jià)連接；
[0071] 其中，（N'）y的序列與(N)x的序列基本互補(bǔ)，并且其中（N)x包含與靶RNA中的連續(xù) 序列互補(bǔ)的反義序列；
[0072] 前提是當(dāng)鞘脂-聚烷基胺綴合物與有義鏈的5'端相連時(shí)，z"不存在。
[0073] 在dsRNA的一些實(shí)施方案中，連接各個(gè)連續(xù)的N或Ν'的各共價(jià)鍵獨(dú)立地選自磷酸二 醋鍵或憐fe^?醋鍵。
[0074]在dsRNA的某些實(shí)施方案中，x = y;并且X和y各自為15至49的整數(shù)，或17至40,優(yōu)選 18至25。在一些實(shí)施方案中，1 = 7 = 19、20、21、22或23。優(yōu)選地4 = 7 = 19或21。
[0075]在某些實(shí)施方案中，x = y=19。在一些實(shí)施方案中，X為19至25的整數(shù)，y為15至17 的整數(shù)，從而產(chǎn)生具有15至17個(gè)核苷酸堿基對(duì)的dsRNA。
[0076] 鞘脂-聚烷基胺綴合物優(yōu)選地與有義鏈(Ν'）y的3'端、反義鏈(N)x的3'端或有義鏈 (Ν'）y的5'端中的至少一者共價(jià)連接;在一些實(shí)施方案中，鞘脂-聚烷基胺綴合物與(N)x的 3'端共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，鞘脂-聚烷基胺綴合物與(Ν'）y的3'端共價(jià)連接。(N)x或 (Ν'）y的3'端可分別包括Z或Z'，例如鞘脂-聚烷基胺綴合物與之相連的核苷酸或非核苷酸 突出(overhang)。所述化合物還可包含與有義鏈的5'端共價(jià)連接的封端部分(z"）。
[0077] 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，鞘脂-聚烷基胺綴合物與(Ν'）y的5'端共價(jià)連接。在這樣 的化合物中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸或非核苷酸部分或其組合與(N)x的3'端和/或(N)y的3'端 共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，鞘脂-聚烷基胺綴合物與(Ν'）y的3'端或5'端相連時(shí)，Z存在。 在一些實(shí)施方案中，鞘脂-聚烷基胺綴合物與(N)x的3'端或(Ν'）y的5'端相連時(shí)，Z存在。 [0078] 在一些實(shí)施方案中，（Ν'）y的序列與(N)x的序列完全互補(bǔ)，（N)x的序列與靶RNA完 全互補(bǔ)。（N'）y的序列還可與(N)x的序列完全互補(bǔ)，并且(N)x的序列與靶RNA部分互補(bǔ)。在這 樣的化合物中，例如，反義鏈[(N)X]的5 '端核苷酸與靶RNA錯(cuò)配。
[0079]在dsRNA的一些實(shí)施方案中，N和Ν'各自為未經(jīng)修飾的核糖核苷酸。
[0080]在dsRNA的一些實(shí)施方案中，Ν或Ν'中的至少一者為經(jīng)糖修飾的核糖核苷酸。
[00811在dsRNA的一些實(shí)施方案中，Ν或Ν'中的至少一者為選自以下的非常規(guī)部分:DNA、 LNA、鏡像核苷酸、2 ' 5 '連接的核苷酸和無堿基部分。
[0082] 在一些實(shí)施方案中，（Ν'）y的序列與(Ν)χ的序列完全互補(bǔ)，并且(Ν)χ的序列與靶 RNA完全互補(bǔ)。
[0083] 在一些實(shí)施方案中，（Ν'）y的序列與(Ν)χ的序列完全互補(bǔ)，并且(Ν)χ的序列與靶 RNA部分互補(bǔ)。
[0084] 在一些實(shí)施方案中，（Ν'）y的序列與(Ν)χ的序列部分互補(bǔ)，并且(Ν)χ的序列與靶 RNA部分互補(bǔ)。
[0085] 在一些實(shí)施方案中，反義鏈[(Ν)χ]的5'端核苷酸與靶RNA錯(cuò)配。
[0086] 在本文所述任意通式的一些實(shí)施方案中，其中靶RNA是mRNA，優(yōu)選人mRNA。在其他 實(shí)施方案中，靶RNA是非編碼RNA，或長(zhǎng)或短，轉(zhuǎn)錄自哺乳動(dòng)物基因組。
[0087] 在另一個(gè)方面，本文提供了包含本文所公開化合物或所述化合物的鹽及載體的組 合物。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化合物包括鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，其包括上 文公開的特征。在一些實(shí)施方案中，所述載體是藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中， 所述組合物配制用于皮下、腹膜內(nèi)或瘤內(nèi)施用。
[0088] 在第三方面，本文提供了用于在患癌受試者中治療癌癥的方法，其包括向所述受 試者施用治療量的鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物，從而治療癌癥。
[0089] 還提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或所述化合物的鹽或包含所述化合物 或所述化合物的鹽的組合物，其用于治療癌癥。
[0090] 還提供了所述鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物或所述化合物的鹽用于制備用于 治療癌癥的藥物的用途。
[0091 ]在又一方面，提供了用于增強(qiáng)治療性寡核苷酸內(nèi)體釋放入細(xì)胞之細(xì)胞質(zhì)的方法， 包括使所述細(xì)胞與鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸相接觸，從而增強(qiáng)內(nèi)體釋放。可以使所述細(xì)胞 直接與所述化合物或與所述化合物的組合物相接觸。還提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化 合物，其用于增強(qiáng)治療性寡核苷酸內(nèi)體釋放入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。
[0092]還提供了鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物用于制備用于增加治療性寡核苷酸內(nèi) 體釋放入細(xì)胞之細(xì)胞質(zhì)的藥物的用途。
[0093]在另一方面，本文提供了鞘脂-聚烷基胺亞磷酰胺。所述亞磷酰胺可用于產(chǎn)生鞘 脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物。在鞘脂-聚烷基胺亞磷酰胺的某些實(shí)施方案中，鞘脂是鞘氨 醇;其中聚烷基胺是精胺或亞精胺。下文中還提供了合成鞘脂-聚烷基胺亞磷酰胺的方法。 [0094]鞘脂-聚烷基胺綴合物與寡核苷酸的偶聯(lián)可以在寡核苷酸的化學(xué)合成期間或之后 實(shí)施，從而形成鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物。鞘脂-聚烷基胺綴合物可以與寡核苷酸的 末端或與寡核苷酸中的內(nèi)在位置相連。鞘脂-聚烷基胺綴合物可偶聯(lián)為亞磷酰胺、H-膦酸酯 或磷酸三酯衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將確定合適的化合物及偶聯(lián)方法。
[0095]該公開內(nèi)容意在涵蓋本文多種實(shí)施方案中公開的特征組合的任意和全部修改或 變化。盡管本文中對(duì)具體實(shí)施方案進(jìn)行了舉例說明和描述，但應(yīng)理解，本發(fā)明涵蓋用于實(shí)現(xiàn) 相同目的的這些實(shí)施方案之特征的任何安排。在閱讀本文描述之后，形成未在本文具體描 述之實(shí)施方案的上述特征之組合對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明顯的。
[0096] 附圖簡(jiǎn)述
[0097]圖1提供了用于生成鞘脂-精胺亞磷酰胺和鞘脂亞精胺亞磷酰胺的化學(xué)合成途徑。 對(duì)該合成的描述提供于下文的實(shí)施例2中。
[0098] 圖2是示出2,鞘脂聚烷基胺siRNA化合物的海腎熒光素酶活性劑量依賴性敲低而 其未綴合的對(duì)應(yīng)物并非如此的圖。
[0099] 圖3是示出鞘脂-精胺siRNA化合物的海腎熒光素酶活性劑量依賴性敲低而其未綴 合的對(duì)應(yīng)物并非如此的圖。
[0100]圖4是示出細(xì)胞提取物和血漿中鞘脂-精胺siRNA的有義鏈和反義鏈的穩(wěn)定性的 PAGE凝膠的圖。
[0101] 圖5是示出血漿中鞘脂精胺siRNA化合物的水平的圖。
[0102] 圖6A、6B和7是示出鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物未激發(fā)免疫應(yīng)答的結(jié)果的圖。
[0103] 圖8是示出鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物未活化補(bǔ)體的結(jié)果的圖。
[0104]圖9A和9B是示出肝和脾中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累積水平的圖。
[0105] 圖10是示出皮下施用之后LLC1腫瘤細(xì)胞中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累積水 平的圖。
[0106] 圖11是示出皮下施用之后LLC1腫瘤細(xì)胞中鞘脂-聚烷基胺siRNA化合物的累積水 平的圖。
[0107] 圖12是示出腫瘤中由鞘脂-精胺siRACl化合物進(jìn)行RAClmRNA的RNAi介導(dǎo)的切割所 得RACE產(chǎn)物的PAGE凝膠圖。
[0108] 圖13A和13B示出未經(jīng)處理和經(jīng)鞘脂-精胺s iRNA處理之細(xì)胞的FACS移位。
[0109] 現(xiàn)在將描述的化合物、方法、材料和實(shí)施例僅為示例性，而無意于限制；與本文所 述的那些相似或等同的材料和方法可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將 從以下詳述和權(quán)利要求顯而易見。
[0110] 發(fā)明詳述
[0111] 本文公開了可用于生成鞘脂-聚烷基胺寡核苷酸化合物的鞘脂-聚烷基胺衍生物， 所述化合物可用于調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，特別是用于下調(diào)靶基因表達(dá)。本文公開的化合物表現(xiàn) 出以下中的一個(gè)或多個(gè):與未經(jīng)修飾的雙鏈核酸化合物相比提高的中革G (on-target)活性、 降低的脫靶活性、增加的攝入細(xì)胞伴隨增加的內(nèi)體釋放入細(xì)胞質(zhì)、提高的核酸酶穩(wěn)定性(核 酸外切酶和/或核酸內(nèi)切酶)和降低的免疫調(diào)節(jié)。不希望受到理論約束，鞘脂-聚烷基胺的存 在通過在核內(nèi)體中產(chǎn)生"質(zhì)子海綿效應(yīng)"為體液中的寡核苷酸提供了穩(wěn)定性、增加細(xì)胞攝入 并促進(jìn)內(nèi)體逃逸。所述分子和組合物能夠下調(diào)、敲低、減弱、降低或抑制靶基因表達(dá)，并且可 用于治療患有與其中基因表達(dá)具有不利后果之疾病或病癥或和/或與這樣的疾病或病癥相 關(guān)的癥狀或有罹患這樣的疾病或病癥之風(fēng)險(xiǎn)的受試者。
[0112] 因此，在某些方面，提供了可用于下調(diào)基因表達(dá)的經(jīng)修飾dsRNA化合物和包含所述 化合物的藥物組合物。所述靶基因是哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物靶基因。
[0113]
[0114] 應(yīng)注意，本文中使用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)形式，另有清楚說明的內(nèi)容除外。當(dāng)本發(fā) 明的方面或?qū)嵤┓桨敢择R庫(kù)什組或其他替代組的形式描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本 發(fā)明還因而以任意單獨(dú)成員或組成員之亞組的形式描述。
[0115] 本文所用術(shù)語"抑制"是指將基因的表達(dá)或所述基因之產(chǎn)物的活性降低至足以獲 得期望的生物或生理效應(yīng)的程度。抑制是完全抑制或部分抑制。
[0116] 術(shù)語"dsNA"和"ssNA"還包括saNA(短活化核酸)分子，其以轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄后水平 誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。例如，活化NA可通過靶向基因啟動(dòng)子誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄活化。 [0117]本文公開的dsNA分子可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)化學(xué)地或生物地合成。
[0118] "siNA抑制劑"、"dsRNA抑制劑"、"dsRNA分子"是能夠?qū)⒒虮磉_(dá)或所述基因之產(chǎn) 物的活性降低至足以實(shí)現(xiàn)期望的生物或生理效應(yīng)之程度的化合物。本文所用術(shù)語"siNA抑 制劑"是指siRNA、shRNA、合成shRNA、miRNA中的一個(gè)或多個(gè)。抑制還可指下調(diào)，或者對(duì)于 RNAi而言沉默。dsRNA分子包括有義鏈和反義鏈，所述有義鏈也稱為過客鏈，其與靶RNA具有 同源性;所述反義鏈也稱為引導(dǎo)鏈，其與有義鏈完全或部分互補(bǔ)。
[0119] 本文所用術(shù)語靶基因的"抑制"或"基因表達(dá)的下調(diào)"意指基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄或翻譯） 或多肽活性的抑制。靶RNA序列的多核苷酸序列是指靶mRNA、靶RNA或與靶mRNA或RNA優(yōu)選地 具有至少70 %同一性、更優(yōu)選80 %同一性、甚至更優(yōu)選90 %或95 %同一性的其任意同源序 列。因此，本發(fā)明涵蓋本文所述經(jīng)過突變、改變或修飾的多核苷酸序列。術(shù)語"mRNA多核苷酸 序列"和"mRNA"可互換使用。
[0120] 術(shù)語"靶RNA"是指與dsNA或ssNA的至少一條鏈同源或互補(bǔ)或者與miRNA具有同源 性的RNA分子。靶RNA分子可以是mRNA (信使RNA)和IncRNA (長(zhǎng)非編碼RNA)或1 incRNA (大基因 間非編碼RNA)，包括但不限于天然反義RNA(AS RNA)和eRNA(增強(qiáng)子RNA)以及pre-miRNA或 pro-miRNA。未經(jīng)加工的mRNA、核糖體RNA和病毒RNA序列也可以是靶標(biāo)。
[0121] 靶RNA通常由dsNA或ssNA調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)通常是指轉(zhuǎn)錄后下調(diào)（例如，通過RNAi或AS活 性)或上調(diào)(例如，通過anti-miR活性）。在一些實(shí)施方案中，ss-或dsNA(單鏈或雙鏈核酸)可 以調(diào)節(jié)其革ERNA而不影響其水平，而非通過調(diào)節(jié)其功能(例如，阻斷miRNA活性的anti-miR)。 在其他實(shí)施方案中，靶RNA是指在NA與靶標(biāo)之間不存在直接序列同源性時(shí)其水平受ssNA和/ 或dsNA影響的RNA。這可發(fā)生在例如當(dāng)靶RNA表達(dá)的活化在轉(zhuǎn)錄水平而非轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)時(shí) 的RNAa情況下。
[0122]本文所用術(shù)語"多核苷酸"和"核酸"可以互換使用，指包括脫氧核糖核酸(DNA)和 核糖核酸(RNA)在內(nèi)的核苷酸序列。該術(shù)語應(yīng)理解為包括由核苷酸類似物產(chǎn)生的RNA或DNA 類似物作為等同物。貫穿本公開，給出了 mRNA序列代表相應(yīng)的基因。
[0123] "寡核苷酸"或"低聚物"是指約2至約100個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)的脫氧核糖核苷酸或核 糖核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸是mRNA。所述寡核苷酸中的每個(gè)DNA或RNA 核苷酸可以獨(dú)立地為天然的或合成的，和/或經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的。修飾包括糖、堿基和核 苷酸間修飾。本文所公開的寡核苷酸包括單鏈分子和雙鏈分子，其調(diào)芐基因表達(dá)。寡核苷酸 包括反義分子(經(jīng)RNAi或RNASEH機(jī)制切割的分子，包括DNA，RNA或DNA/RNA嵌合體）、雙鏈RNA (dsRNA)(包括8丨卩祖、8丨嫩、!^1?祖、8&1?祖等）、抗1^1?、1^財(cái)莫擬物、核酶、適體、外顯子跳躍分 子、合成mRNA等。"調(diào)芐基因表達(dá)"包括下調(diào)（例如，siRNA)基因表達(dá)或上調(diào)（例如，saRNA)基 因表達(dá)。
[0124]如本文中使用的，"接頭（linker)"和"鍵(linkage)"是指連接一個(gè)化學(xué)部分與另 一化學(xué)部分的一個(gè)或多個(gè)原子，例如鞘脂-聚烷基胺與亞磷酰胺或鞘脂-聚烷基胺與寡核苷 酸。接頭是含一個(gè)原子或例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)