一種O型口蹄疫病毒多肽與SLA-2重鏈、輕鏈β2m復(fù)性結(jié)晶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種0型口蹄疫病毒多肽與荷包豬SLA-2重 鏈、輕鏈Km復(fù)性、結(jié)晶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，簡稱MHC，是 脊椎動物所具有的與免疫應(yīng)答相關(guān)的一類基因群。MHC分為I，II和III類。其中，MHCI類分 子與細(xì)胞免疫應(yīng)答有關(guān)，這是由MHCI類分子特殊的空間結(jié)構(gòu)決定的。從上世紀(jì)八十年代開 始，人們逐漸開始了對MHCI類分子晶體結(jié)構(gòu)的研究。
[0003]人的MHC，亦稱為人的白細(xì)胞抗原（humanleukocyteantiger^HLAhigS?年，Bjorkman等(Nature，1987,6139:506-512)首次解析了人的HLA-A2的三維晶體結(jié)構(gòu)，MHCI 由重鏈α和輕鏈β2微球蛋白組成。重鏈α包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，其中胞外區(qū)部分由3 個結(jié)構(gòu)域組成:α1、α2和α3,每個結(jié)構(gòu)域包含大約有90個氨基酸;跨膜區(qū)的結(jié)構(gòu)域由大約25 個疏水氨基酸構(gòu)成，帶有一段帶電的親水氨基酸;胞內(nèi)錨定的部分由30個氨基酸殘基組成。 其中，α?與α2具有相似的三級結(jié)構(gòu)，α3與β2πι具有相似的折疊。β2πι以99個氨基酸的折疊與α 鏈通過非共價鍵結(jié)合，無跨膜區(qū)。MHCI類分子中的α3與β2πι靠近細(xì)胞膜，α3通過它的疏水跨 膜部分和親水的胞內(nèi)部分鑲嵌在細(xì)胞膜內(nèi)。α?與α2形成整個分子的頂部，螺旋狀結(jié)構(gòu)域指 向胞外，用于被TCR識別。
[0004] 豬的MHC又稱豬白細(xì)胞抗原（swineleukocyteantigen，SLA)，其基因組區(qū)域只有 1 · 1Mb，是目前已知最小的哺乳動物MHC基因連鎖群(Renard，etal.，Genomic，2006，88:96-lOOhSLA位于豬的7號染色體上，分為classI、classII和classIII三類區(qū)域基因。II類 區(qū)域基因位于長臂上，I和III類區(qū)域基因位于短臂上，分別靠近端粒和著絲粒。
[0005]SLA-2基因是豬SLA-Ι類分子重要的基因座，與SLA-l，SLA-3-起構(gòu)成I類分子的3 個典型的功能基因群。
[0006]張念之等(JVirol,2011,22:11709-11724)最近解析了豬SLA-1*0401晶體結(jié)構(gòu)。 該研究中，SLA-1*0401和流感多肽S-0IV-NA449-457(NSDTVGWSW)及埃博拉病毒多肽Ebola virus-vp35155-163(ATAAATEAY)成功獲得晶體。
[0007]然而，到目前為止，豬SLA-2的晶體結(jié)構(gòu)還未見報道。尤其缺乏口蹄疫病毒多肽與 SLAI類分子形成晶體的研究。課題組長期研究豬SLAI類分子，并專注于口蹄疫病毒表位 的設(shè)計和篩選。在前期研究的基礎(chǔ)上，以實驗室構(gòu)建的荷包豬SLA-2重鏈和i32m輕鏈為蛋白， 與一優(yōu)化篩選出的〇型口蹄疫病毒多肽表位在體外進(jìn)行復(fù)性，并獲得晶體，解析SLA-2晶體 結(jié)構(gòu)，為今后更加準(zhǔn)確設(shè)計豬源病毒多肽表位提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是:研究豬SLA-2與i32m與多肽形成的復(fù)合體空間結(jié)構(gòu)，解析SLA-2空 間結(jié)構(gòu)，為今后詳細(xì)研究SLA-2的抗原遞呈功能提供了依據(jù)。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案為：以荷包豬為例，構(gòu)建SLA-2胞外部區(qū)原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿 主菌獲得表達(dá)蛋白及其包涵體(SLA-2-HB)。利用netMHCpan2.8設(shè)計與SLA-2-HB匹配的口蹄 疫病毒流行毒株多肽，與重鏈SLA-2-HB、輕鏈si32m成熟肽按照摩爾比3:1:1通過稀釋復(fù)性法 進(jìn)行共結(jié)合，通過分子篩檢測。分離復(fù)性蛋白質(zhì)復(fù)合物并濃縮，調(diào)整復(fù)合物濃度分別為 7.5mg/mL和1Omg/mL的濃度，在晶體生長液中進(jìn)行晶體的生長。結(jié)果顯示，SLA-2-HB表達(dá)蛋 白大小約為33kDa，在si32m存在的情況下，能夠與0型口蹄疫多肽Hu62成功復(fù)性。當(dāng)晶體濃度 為1Omg/mL的時候，用HamptonResearch試劑盒篩選出現(xiàn)高質(zhì)量的晶體，分辨率為2.5.Αβ.晶 體經(jīng)解析后分析顯示，SLA-2-HB-Hu62-si32m呈現(xiàn)雙分子的構(gòu)型，進(jìn)一步分析揭示造成這種 構(gòu)象差異的主要是在第二位和第四位氨基酸的折疊存在差異，具體步驟如下。
[0010] 1、引物設(shè)計與合成
[0011] 依據(jù)荷包豬SLA-2全基因編碼序列，分別設(shè)計擴(kuò)增其胞外區(qū)的上游引物和下游引 物：
[0012]
[0013] 2、多肽的合成
[0014] 通過預(yù)測網(wǎng)站NetMHC2.8Server以0型 口蹄疫（Foot-and-mouthdisease，F(xiàn)MDV) 病毒毒株HQ116229-FMDV-0-HuBHK99的全序列，設(shè)計了Hu62 口蹄疫病毒多肽，序列為： ALLRTATYY。
[0015] 3、SLA-2-HB胞外區(qū)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0016] 用pHB21F/pHB-21Rl作為引物對，以荷包豬SLA-2-HB01/pMD18-T全基因重組質(zhì)粒 為模板，擴(kuò)增荷包豬SLA-2胞外區(qū)部分，PCR產(chǎn)物5'端帶有NdeI限制性酶切位點(diǎn)CA/TATG，3' 端帶有XhoI限制性酶切位點(diǎn)CT/CGAG。建立如下PCR反應(yīng)體系，總體積為50yL:
[0019]PCR反應(yīng)條件為
[0021] PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，并經(jīng)過NdeI和XhoI雙酶切后，與經(jīng)過同樣酶切回收處理的 pET-21a(+ )空載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶 切鑒定篩選陽性克隆，并測序。
[0022] 4、誘導(dǎo)表達(dá)、包涵體提取及SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)蛋白
[0023]測序正確的SLA-2重鏈陽性克隆菌與輕鏈si32m表達(dá)菌在有Amp抗性的固體LB平板 上劃線，平板在37°C培養(yǎng)12小時，挑取單菌落至裝有3mLLB+3yLAmp(100mg/mL)培養(yǎng)基的試 管中培養(yǎng)1 〇h，把培養(yǎng)好的菌液50yL接入裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的錐形瓶內(nèi)，培養(yǎng)基內(nèi)加 入50yL的Amp，錐形瓶37°C恒溫振蕩過夜培養(yǎng)。用大三角瓶配制2L的LB液體培養(yǎng)基，121°C 20min滅菌。將過夜培養(yǎng)的菌往大三角瓶內(nèi)按1:100的比例接種，并加入2mL(100mg/mL)的 Amp。在大搖床內(nèi)37°C恒溫震蕩培養(yǎng)約2個小時測0D值，直至0D為0.5時加入2mL的IPTG (lmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)，37°C培養(yǎng)5h后收菌。將培養(yǎng)的菌轉(zhuǎn)入500mL的離心杯中，4°C，6000rpm， 15min收菌，倒掉上清只留菌體沉淀。收菌后(接下去步驟都在低溫下進(jìn)行），用60ml左右IX PBS懸浮(60μ1DTT，1%〇)，超聲裂解(超6S，間隔12S，99+99次，250W左右）。中間看是否有沉 淀，有則攪拌，之后超聲。16000rpm，15min，4°C，用玻棒將細(xì)菌碎片撥掉，washingbuffer (共100mL+100yLDTT，l%〇)洗3次。每次超聲:43，103,25次，2501左右，超聲條件可以自行調(diào) 整。每次超聲后16000rpm，15min，washingbuffer洗滌，盡量去除細(xì)菌碎片。稱重。 16000rpm，15min，resuspensionbuffer(60mL+60yLDTT，1%。）懸浮。16000rpm，15min，按 30mg/ml用dissolutionbuffer(按1 %加入DTT)溶解，4°C攪拌溶解（過夜）。16000rpm， 15min，倒出上清或分裝成lml/管，于-20°C或_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024] 5、重鏈SLA-2-HB、輕鏈sf32m及其口蹄疫病毒表位多肽的體外結(jié)合
[0025] 荷包豬重鏈SLA-2-HB、輕鏈f32m與口蹄疫病毒Hu62表位肽在體外結(jié)合：
[0026] (1)稀釋法復(fù)性蛋白質(zhì)
[0027]①配制500mLrefoldingbuffer(100mmol/LTris，pH8.0,400mmol/LL_Arg HCl，2mmol/LEDTA，5mmol/LGSH，0.5mmol/LGSSH(復(fù)性液預(yù)冷后加入)0.5mmol/LPMSF)， 4°C緩慢攪拌至其完全溶解混勻。
[0028] ?用51^或1〇11^注射器將溶解后的包涵體（約3-51111，可分3次加，每次間隔8-10小 時左右)加入注射器內(nèi)，使之一滴一滴的往refoldingbuffer內(nèi)滴下（如果用的是尿素溶解 的話，包涵體應(yīng)該會凍了起來，可用injectionbuffer溶解后再加入注射器內(nèi)），慢慢攪拌 8-10小時(可適當(dāng)延長時間）。（在4°C條件下進(jìn)行）。先加i32m，再加多肽，最后加重鏈(重鏈分 三次加），重鏈:輕鏈:多肽= 1:1:3(摩爾比）。
[0029]③復(fù)性后，可用濃縮杯濃縮樣品換液（適合于此蛋白的緩沖液，一般為分子篩 buffer)，再轉(zhuǎn)到濃縮管內(nèi)濃縮，如果復(fù)性體系小的話可直接用濃縮管濃縮換液。（復(fù)性后如 果復(fù)性液變得渾濁，可低溫離心去除沉淀后再濃縮。）（4°C條件下進(jìn)行）
[0030] (2)蛋白質(zhì)濃縮
[0031 ] 將復(fù)性蛋白質(zhì)體系轉(zhuǎn)入到500mL的離心管內(nèi)6000rpm，4°C離心15min，去沉淀。在4 °C冷庫將上清轉(zhuǎn)入到350mL的攪拌式超濾裝置(Sti